肠道细菌感染与炎症性肠病的关系

邱骅婧，刘占举

(同济大学附属第十人民医院消化内科，上海 200072)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)包括克罗恩病(Crohn's disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，其主要临床表现为黏液脓血便、腹痛、大便次数增多和体质量的下降等［1］。IBD的发病机制目前尚不明确，诱发IBD的四大要素为基因异常、免疫调节紊乱、肠屏障功能受损和肠道菌群改变［2］。研究表明，多种细菌在该疾病发生及进展中发挥重要作用，如难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile，Cd)、沙门氏菌(salmonella，Sm)和金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，Sa)［3-5］，能通过黏附于肠黏膜上皮细胞对其进行破坏，并诱导疾病复发［6］。本研究通过观察上述3种细菌在IBD患者和健康者中的表达差异，分析肠道细菌感染与炎症性肠病的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年6月至2013年11月在同济大学附属第十人民医院消化内科确诊的IBD患者180例及80例健康者，诊断标准参照中国炎症性肠病诊疗共识意见［7］。病例排除标准:(1)病程短于3个月;(2)4周内使用头孢类、甲硝唑、青霉素和万古霉素抗生素;(3)正进行灌肠及肠道准备者。详细记录每位IBD患者的年龄、性别、疾病分型、内镜检查、治疗方法和吸烟史等临床资料。

1.2 酶联免疫吸附试验

抽取空腹患者和健康者的静脉血液2 ml，简单离心后收集血清并立即储存于80℃冰箱中直至使用。血清样本进行Cd、Sm、Sa的双抗体夹心ELISA检测(购自美国RD公司)，每块96孔板上设置阴性对照2孔，阳性对照2孔，空白对照1孔，样品采用复孔检测，最后使用BioTek Synergy2仪器于450 nm波长处读取空白孔调零后的各孔吸光度值(D450)。试验有效性判定:阳性对照孔平均值≥1.00，阴性对照孔≤0.10。临界值阴性对照孔0.15，样品D450≥临界值为细菌感染阳性。

1.3 PCR 试验

使用无菌EP管收集患者和健康者清晨第1次排便时的粪便约1 g(或1 ml)，30 min内储存于80℃冰箱中，并于24 h内使用粪便DNA提取试剂盒进行提取(购自中国天根公司)，DNA的D260/D280比值均在1.7～1.9范围内。标准菌株购自国家菌种保藏中心，细菌引物由上海生工公司合成，使用TaKaRa公司SYBR Premix EX Taq试剂盒对DNA样品和标准菌株DNA进行扩增检测。

难辨梭状芽孢杆菌毒素A(158 bp)上游引物:5'-TCTACCACTGAAGCATTAC-3';下游引物:5'-TAGGTAC-TGTAGGTTTATTG-3'。沙门氏菌stn基因(260 bp)上游引物:5'-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3';下游引物:5'-TGCCCAAAGCAGAGAGATTCTG-3'。金黄色葡萄球菌femB基因(93 bp)上游引物:5'-AATTAACGAAATGGGCAGAAACA-3';下游引物:5'-TGCGCAACACCCTGAACTT-3'。

1.4 病例分组

本实验包括100例CD和80例UC，其中52例活动期 CD(A-CD)、48例缓解期 CD(R-CD)、41例活动期 UC(A-UC)、39例缓解期 UC(RUC)，通过克罗恩病疾病活动指数(Crohn's disease activity index，CDAI)、克罗恩病内镜下评分(the simple endoscopic score for Crohn's disease，SESCD)和Mayo指数分别对CD和UC的病情严重程度进行评分，活动期CD患者CDAI评分超过150，活动期 UC患者 Mayo指数超过3［8］。ELISA和PCR方法同时能够检测出时，可判定存在细菌感染。

1.5 统计学处理

所有数据均使用SPSS 17.0统计软件进行分析。应用ANOVA分析各组间D值差异，χ2检验用来评价细菌感染阳性和阴性两组间各项指标是否存在差异，数值以表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况分析

在参与此次研究的180例IBD患者中，平均年龄(38.85 ±17.06)岁，男女比例 1.2∶1，平均病程(4.58±2.15)年。在 80例健康者中，平均年龄(28.52 ±9.08)岁，男女比例 1∶1。

2.2 各组难辨梭状芽孢杆菌感染情况分析

IBD患者Cd感染率为10.6%(19/180)，显著高于健康组，差异有统计学意义(P=0.003)，其中活动期CD患者Cd感染率17.3%(9/52)，活动期UC患者Cd感染率21.9%(9/41)，见表1。处于活动期CD或UC患者Cd感染率显著高于缓解期患者(P=0.008，0.022)，而CD 组与UC 组Cd 感染率差异无统计学意义(P=0.448)。使用ANOVA分析可见，活动期CD患者OD值显著高于缓解期CD患者(P=0.024)，而活动期UC患者OD值与缓解期UC患者差异无统计学意义(P=0.062)。

表1 各组难辨梭状芽孢杆菌感染情况比较Tab.1 Comparison of the intestinal infection of Clostridium difficile in different groups

2.3 各组沙门氏菌感染情况分析

IBD患者沙门菌感染率为8.3%(15/180)，显著高于健康组，差异有统计学意义(P=0.018)，其中活动期CD患者感染率为13.5%(7/52)，活动期UC患者感染率为19.5%(8/41)，见表2，处于活动期CD或UC患者沙门菌感染率显著高于缓解期患者(P=0.025，0.011)，而 CD 组与 UC 组感染率差异无统计学意义(P=0.469)。使用ANOVA分析可见，活动期CD和UC患者D450值均显著高于缓解期患者(P=0.015，0.01)。

表2 各组沙门氏菌感染情况比较Tab.2 Comparison of the intestinal infection of Salmonella in different groups

2.4 各组金黄色葡萄球菌感染情况分析

IBD患者金黄色葡萄球菌感染率为7.8%(14/180)，显著高于健康组，差异有统计学意义(P=0.023)，其中活动期CD患者感染率为13.5%(7/52)，活动期UC患者感染率为17.1%(7/41)，见表3，处于活动期CD或UC患者金葡菌感染率显著高于缓解期患者(P=0.025，0.021)，而CD组与UC组的感染率差异无统计学意义(P=0.663)。使用ANOVA分析可见，活动期CD和UC患者OD值均显著高于缓解期患者(P=0.000，0.005)。

表3 各组金黄色葡萄球菌感染情况比较Tab.3 Comparison of the intestinal infection of Staphylococcus aureus in different groups

2.5 临床特征与细菌感染关系

在发生Cd、Sm和Sa感染的各19、15和14例IBD 患者中，分别有 84.2%(16/19)、86.7%(13/15)和85.7%(12/14)的患者的病变部位包含结肠，有 84.2%(16/19)、80.0%(12/15)和 92.9%(13/14)的患者使用激素治疗，有 78.9%(15/19)、93.3%(14/15)和92.9%(13/14)的患者使用美沙拉嗪治疗，有 100%(19/19)、86.7%(13/15)和92.9%(13/14)的患者使用免疫抑制剂治疗，有31.6%(6/19)、40.0%(6/15)和 42.9%(6/14)的患者有吸烟史。而在相应未发生Cd、Sm和Sa感染的 IBD 患者中，分别有 57.1%(92/161)、55.8%(92/165)和54.2%(90/166)的患者的病变部位包含结肠，有 37.3%(60/161)、36.4%(60/165)和37.3%(62/166)的患者使用激素治疗，有 80.7%(130/161)、90.9%(150/165)和 87.3%(145/166)的患者使用美沙拉嗪治疗，有18.6%(30/161)、24.2%(40/165)和 18.1%(30/166)的患者使用免疫抑制剂治疗，有 24.8%(40/161)、33.3%(55/165)和30.1%(50/166)的患者有吸烟史。分析可得，病变部位包含结肠或使用激素及免疫制剂治疗的IBD患者的Cd、Sm和Sa的感染率明显增高，组间差异有统计学意义(P＜0.05)，而IBD患者的吸烟史及美沙拉嗪治疗与上述3种细菌的感染无显著关联(P ＞0.05)。

3 讨 论

正常人肠道大约有上亿个细菌，重量约1 kg，相当于一个正常成人的肝脏。肠道共生菌在人体免疫调节、营养吸收和解除毒素方面发挥着重要作用［9］。高糖、高脂肪、高蛋白质及低纤维饮食会逐渐破坏肠道菌群的稳态［10］。肠道细菌稳态的失衡不仅能够诱发肠道发生炎症损伤，而且肠道菌群与肠道黏膜之间反应通路异常会导致肠道肿瘤发生［11］。随着饮食及生活习惯与西方国家逐渐相近，近年来IBD在我国的发生率逐年升高，虽然肠道细菌组成的多样性已被报道［12］，但有关我国IBD患者肠道细菌感染的研究仍较少。梭状芽孢杆菌是一种阳性厌氧致病菌，其感染率在IBD患者中高，不利于疾病的缓解与愈合［13］。沙门菌通过转运肠滤泡上皮细胞进入扁平细胞，使肠道黏膜抵抗侵袭能力下降［14］。金黄色葡萄球菌是一种机会致病菌，能够黏附于人体肠道黏膜，但某些乳酸细菌通过抗黏附和抗微生物作用对其进行替代［15］。HLA B27转基因小鼠在无菌环境中不发生结肠炎，而灌肠注入普通拟杆菌等侵袭性细菌后，小鼠发生轻度至中度的结肠炎［16］。迄今为止，只有10% ～40%的细菌能够进行人工培养基培育，提高了鉴定肠道菌群种类的难度。

本研究结果显示，IBD患者肠道细菌感染率高于健康者，活动期患者高于缓解期患者。三种细菌中Cd感染率最高为10.6%，1例UC患者同时感染三种细菌，1例CD患者和1例UC患者同时感染沙门菌与金葡菌，2例UC患者同时感染Cd与沙门菌。病变部位包含结肠或使用激素及免疫制剂治疗的IBD患者的感染率明显增高，组间差异有统计学意义(P＜0.05)，而IBD患者的吸烟史及美沙拉嗪治疗与上述3种细菌的感染无显著关联(P＞0.05)。虽然细菌感染率在IBD患者中较低，但细菌及毒性产物对疾病的发生和发展起着关键作用，检测肠道细菌感染能帮助临床医师更好地评估患者病情。

由于本次研究中样本量较少，只针对3种细菌进行检测，无法排除其他细菌在炎症性肠病中的重要作用。IBD中肠道菌群的多样性尚需大样本研究，细菌感染机制及合并细菌感染的IBD患者的相关临床治疗需要深入探讨。

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