缺氧缺血性脑病足月新生儿外周血单个核细胞向神经细胞分化潜能的临床意义

魏 东，张毓文

(同济大学附属同济医院儿科，上海 200065)

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是导致患儿脑瘫、癫等神经系统疾患，危及新生儿健康，关系到我国人口素质的一个重要疾病。对重度HIE病例而言，在临床上尚无有效的药物和特殊方法。而干细胞治疗为HIE治疗指出了一个新的方向［1］。窒息对新生动物大脑神经干细胞的影响已有不少报道［2-4］。现已证实外周血干细胞在大脑缺血缺氧脑损伤的修复中有重要作用［5］。本实验对窒息新生儿外周血单个核细胞(含干细胞)向神经细胞分化能力及与临床关系进行研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2007年3月至2010年3月同济医院儿科收治的HIE足月新生儿50例，生后满72 h进行HIE分度评估，其中重度20例，中度和轻度各10例，所有患儿符合HIE诊断标准［6］。重度HIE患儿生后第14天临床症状明显好转者10例(无意识改变、无抽搐、无颅内高压、无肌张力改变、无脑干症状)，无好转(具有前述症状之一或以上者)或死亡者10例(1周内死亡2例，1周后死亡者8例)。同时期出生的足月新生儿湿肺患儿10例为对照组，有气急、吸凹，但经皮氧饱和度正常。

1.2 研究方法

1.2.1 分离单个核细胞 所有患儿及对照组均在入院3 h内(出生24 h内)、生后第7天(重度HIE患儿若第7天仍成活)无菌条件下抽取外周血5 ml。以Ficoll分离液分离单个核细胞，收集单个核细胞并用下述增殖培养基配成培养细胞悬液。

1.2.2 外周血单个核细胞增殖培养 根据文献［7］配制增殖培养基，成分为DMEM培养液(Gibco公司)，10%胎牛血清(Gibco公司)，青霉素(上海新先锋制药公司)100 U/ml，链霉素(华北制药公司)100 μg/ml。细胞以1 ×107/ml的密度每孔 2 ml接种于6孔培养板中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中增殖培养3 d。

1.2.3 外周血单个核细胞诱导分化培养 根据文献［7］进行:增殖培养3 d后吸除培养液，加入无菌PBS轻轻吹打洗涤2次，除去未贴壁的细胞，取2孔继续加入增殖培养基为非诱导分化阴性对照，另外4孔加入分化培养基，成分为DMEM/F12培养基，10%胎牛血清，青霉素 100 U/ml，链霉素 100 μg/ml，全反式维甲酸(Sigma 公司)0.5 μmol/L，神经生长因子(Sigma公司)100 ng/ml，胰岛素(Bo-Yun Biotech)25 μg/ml，转 铁 蛋 白 (Bo-Yun Biotech)100 μg/ml，肝素(2 ml:12500 u，万邦医药)2 μg/ml，黄体酮(上海医药有限公司)60 nmol/L。置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。每3 d半量换液1次，在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况，至分化培养第10天，进行免疫组织化学鉴定。

1.2.4 细胞的免疫组织化学鉴定 各培养孔以4%多聚甲醛固定细胞25 min。用PBS充分洗涤5次。滴加1 g/L的Triton透化15 min，以PBS充分洗涤5次。滴加3%双氧水浸润10 min，阻断细胞内过氧化物歧化酶，以PBS洗涤5次。培养板各孔内滴加免疫组织化学法试剂盒(杭州百通生物技术有限公司)中的试剂A(正常马血清)避光常温孵育45 min封闭抗原，加浓度为5 μg/ml抗-Nestin抗体(R＆D公司)，4℃避光孵育过夜。取出过夜后标本，以PBS充分浸泡洗涤5 min×5次，每孔滴加试剂盒中试剂B(生物素标记的二抗)，室温避光孵育60 min，取出后以PBS充分浸泡洗涤5 min×5次。加试剂C(辣根-过氧化物酶复合物)室温孵育15 min后PBS充分洗涤5 min×5次。每孔标本滴加现配DAB显色液显色3～6 min，显微镜下观察，控制显色时间、细胞着色程度。双蒸水充分冲洗后，显微镜下观察、拍照，每孔计免疫组化阳性细胞数，并以细胞形态进一步确认:至少有两个以上的长突起方计为阳性。取4孔阳性细胞数平均值。

1.3 统计学处理

2 结 果

各组间患者性别、分娩方式、生后时间、孕周、体质量等差异无统计学意义，见表1。

所有重度HIE患者均有气管插管和机械通气。体外细胞培养10 d后，单个核细胞中出现Nestin染色阳性，具有突起的神经细胞样细胞(见图1)。窒息后轻、中、重度HIE预后好者、重度HIE预后差者新生儿外周血单个核细胞分化为有神经细胞标志Nestin的细胞数分别为70.46 ±6.66，73.34 ±6.46，68.99 ±7.85，71.43 ±6.88，与对照组 71.13 ±7.19比较差异无统计学意义(F=0.506，P=0.732)。重度HIE患儿症状好转者外周血单个核细胞分化为有神经细胞标志Nestin的细胞数，第7天(94.50±15.57)较生后 3 h(68.99 ± 7.85)明显增高(t=4.657，P=0.000)，且高于同时期症状无明显好转者(69.48 ±5.32，t=4.621，P=0.000;8 例，因为 2例在1周内死亡，第7天数据缺失，故从研究中删除此2 例)，后者与其生后 3 h(72.60 ±7.27)比较，差异无统计学意义(t=1.465，P=0.165)。

表1 研究对象一般临床资料Tab.1 The clinical data of the patients (，n)

表1 研究对象一般临床资料Tab.1 The clinical data of the patients (，n)

组别 生后时间/h 孕周/周 出生体质量/g 性别 分娩方式女 剖腹产 阴道分娩对照组 11.82 ±7.38 38.64 ±1.10 3333.35 ±464.65 6 4 7 3轻度 HIE 组 8.27 ±6.54 39.10 ±1.64 3112.47 ±362.71 5 5 6 4中度 HIE 组 13.79 ±6.88 39.11 ±1.56 3233.18 ±491.89 6 4 5 5重度 HIE 预后好组 13.25 ±6.53 39.13 ±1.50 3186.28 ±536.04 7 3 4 6重度 HIE 预后差组 9.78 ±7.5 39.10 ±1.56 3241.14 ±485.28 4 6 3 7 F(χ2) 1.118 0.202 0.294 2.168 3.937 P 0.360 0.936 0.880 0.820 0.494男

图1 新生儿外周血单个核细胞诱导分化为Nestin阳性细胞Fig.1 PMCs induced to differentiate into Nestin positive cells

3 讨 论

HIE仍是目前导致新生儿神经系统后遗症的重要疾病。对重度病例缺乏有效的治疗方法。很多研究发现缺血缺氧脑损伤时机体动员内源性干细胞，即大脑中的神经干细胞参与HIE的修复［1］。同时也有研究发现外周血干细胞与HIE脑损伤修复有密切关系［5］。

脐血单个核细胞中含有神经细胞分化潜能的多能干细胞［8］和间充质干细胞［9］。新生儿外周血中是否有神经细胞分化潜能的细胞?本实验证实，新生儿以及窒息新生儿外周血单个核细胞也可分化为具有神经细胞标志的细胞，即具有分化为神经细胞的潜能。

窒息对新生儿外周血干细胞分化为神经细胞的影响目前尚未见文献报道。缺血缺氧对大脑中的神经干细胞有明确影响，Zádori等［10］发现缺氧对成年小鼠大脑神经干细胞的体外活力和增殖没有影响，但减弱其体外向神经细胞的进一步分化，缺氧时小鼠大脑神经干细胞在损伤区域仍能生存和增殖，但不能分化为神经元。Plane等［2］发现新生大鼠缺血缺氧后促进前脑脑室下区神经细胞生成。Brazel等［3］则发现新生小鼠脑室下区神经前体细胞对缺氧缺血损伤敏感，易致神经前体细胞耗竭。国内尹晓娟等［4］观察了新生7日龄大鼠HIE病程中NSC随着HIE病变的变化而发生着改变，NSC基本上随病程的延长而减少。Romanko等［11］发现神经元的前体细胞对缺氧和缺血敏感，而神经干细胞则对其有较强的耐受力。本研究未发现窒息对新生儿外周血单个核细胞分化为神经细胞的能力有影响。这提示窒息对中枢神经干细胞和外周血有神经细胞分化潜能干细胞的影响是不同的。

本研究发现，重度HIE患儿恢复良好者生后第7天外周血单个核细胞向神经细胞分化的能力明显增强，提示外周血干细胞在HIE的修复中有重要作用。外周血干细胞在窒息时参与中枢修复的机制尚不清楚，可能与直接进入中枢分化为神经细胞替代受损脑组织或产生神经营养因子促进大脑内源性神经干细胞增殖分化有关。脐血干细胞用于治疗新生动物HIE的实验最早报道于2006年［12］，在7日龄大鼠HIE模型中，缺血缺氧后24 h，由腹腔注入1×107人脐血细胞，生后21 d发现治疗组运动功能有较好的改善，且在缺血的脑组织中发现很多人脐血细胞。彦小华等［13］用脐血间充质干细胞静脉移植治疗新生大鼠缺血缺氧性脑损伤，发现脐血间充质干细胞可以透过血脑屏障，分布在损伤的脑组织周围，减轻脑水肿和脑损伤。因此，外周血干细胞在窒息时可能直接进入中枢分化为神经细胞替代受损脑组织，从而起到修复作用。Yasuhara等［14］发现，由HIE大鼠静脉注入1×107人脐血细胞，可以减轻缺血缺氧所致的运动平衡和运动协调缺陷，治疗组3 d后脑中神经生长因子、胶质源性神经营养因子、脑源性神经营养因子明显升高，提示这些移植的细胞可能具有旁分泌功能。脐血在体外培养的情况下可以产生多种神经营养因子和细胞因子［15-16］，因此，人外周血干细胞也可能以类似于旁分泌或内分泌的方式产生的各种神经营养因子参与窒息受损脑组织修复。

重度HIE新生儿外周血单个核细胞向神经细胞分化潜能与中枢症状改善有密切关系。但外周血单个核细胞参与窒息时中枢损伤保护的机制尚有待进一步研究。

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