PDGF-D与MPO在大肠癌组织中的表达及临床意义

毛晓光，谭 湘，杨志伟，王燕颖

1.黑龙江省医院普外科，黑龙江 哈尔滨 150036;2.新疆阿勒泰地区富蕴县人民医院内科

大肠癌(colorectal cancer)是大肠黏膜上皮和腺体发生的恶性肿瘤。在全球最常见的恶性肿瘤中，大肠癌的发病率高居第4位。近年来我国大肠癌的发病率和死亡率均呈上升趋势。而肿瘤晚期的转移，已成为大肠癌高死亡率的主要原因。因此，大肠癌早期诊断，对改善患者的治疗及预后具有极其重要的意义，而新的肿瘤标志物的识别对癌症的早期诊断和治疗具有重要的临床意义。髓过氧化物酶(MPO)是一种糖蛋白，又是活化多环芳烃类致癌物的代谢酶[1]，具有肿瘤细胞毒作用。血小板源性生长因子 D(PDGF-D)是PDGF家族的新成员，它参与肿瘤的发生、发展的多个过程，对肿瘤的侵袭、转移、血管形成都有促进作用[2]。本研究采用免疫组化的方法检测在研究大肠癌及大肠腺瘤中PDGF-D和MPO的表达，以探讨其在结肠癌中的发生与临床病理因素之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集黑龙江省医院2012年1月－2013年4月消化内科内镜中心活检和住院手术患者的石蜡包埋组织标本160例，其中大肠癌88例，大肠腺瘤72例，所有标本均已经病理证实。88例大肠癌组织中，男50例，女38例，平均年龄(63.2±5.1)岁。根据组织学形态用三级分法来判断浸润癌的分化程度，Ⅰ级为高分化，Ⅱ级为中分化，Ⅲ级为低分化。其中高分化癌7例，中分化癌47例，低分化癌34例。72例大肠腺瘤组织中，男39例，女33例，平均年龄(58.4±6.3)岁;兔抗人MPO多克隆抗体;免疫组化试剂盒及DAB显色剂购自福州迈新生物技术开发有限公司;PDGF-D山羊抗人抗体购自美国R＆D公司。

1.2 方法 石蜡包埋的组织连续切片4 μm的厚度，切片常规脱蜡和水化后，对组织抗原进行相应的修复。采用二步法染色步骤将每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10 min后，PBS缓冲液洗3 min×3次。除去PBS液，每张切片滴加一抗工作液(兔抗人MPO，山羊抗人PDGF-D)，在室温下孵育1 h。PBS缓冲液洗3 min×3次。滴加Max Vision试剂，在室温下孵育15 min。缓冲液洗3 min×3次。除去PBS液，滴加DAB溶液，在室温下孵育10 min。自来水充分冲洗、苏木素复染、脱水、透明、封片、光学显微镜下观察。

1.3 染色结果判定 为证实在免疫组化染色中所用第一抗体的有效性和可靠性设立同步免疫染色对照，采用空白对照:以缓冲液PBS取代第一抗体，其他各步不变的试剂对照染色，结果为阴性。已知阳性切片为阳性对照。每例随机观察10个视野，依照阳性细胞数量，可分为:弱阳性(+:指阳性细胞总数在25%以下);中等阳性(++:指阳性细胞总数在25～49%);强阳性(+++:指阳性细胞总数在50%以上)。

1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，计数数据计算阳性率、样本率的比较采用卡方检验，两个变量之间的相关性测试由Spearman等级相关分析。计量资料用表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDGF-D、MPO蛋白的表达 MPO阳性表达以细胞膜和细胞浆出现棕褐色颗粒为阳性细胞(见图1)。PDGF-D阳性表达以细胞浆出现深棕色颗粒为阳性细胞(见图2)。PDGF-D在大肠癌及大肠腺瘤组织中均有部分呈阳性表达，大肠癌中阳性表达75例;大肠腺瘤中阳性表达25例，差异有统计学意义(χ2=43.10，P ＜0.01)，MPO 在大肠癌中阳性表达56 例，大肠腺瘤中20例。采用卡方检验，差异有统计学意义(χ2=20.42，P ＜0.01)。PDGF-D 与 MPO 在大肠腺瘤组织中的表达，与大肠癌组比较差异均有统计学意义(见表1)。

图1 MPO在大肠癌中的表达(400×);图2 PDGF-D在大肠癌中的表达(400×)Fig1 Expression of MPO in colorectal cancer tissues(400×);Fig2 Expression of PDGF-D in colorectal cancer tissues(400×)

表1 PDGF-D与MPO在大肠癌及大肠腺瘤中的表达Tab1 Expression of PDGF-D and MPO in colorectal adenomas and colorectal cancer

2.2 PDGF-D和MPO在大肠癌中的表达与临床病理特征的关系 PDGF-D和MPO在大肠癌组织中的表达与有无淋巴结转移密切相关(P＜0.05)。PDGFD和MPO在大肠癌组织中的表达与性别、年龄及组织分化程度均无相关性(P＞0.05，见表2)。

2.3 PDGF-D及MPO表达的联合分析结果 根据PDGF-D及MPO在大肠癌组织中的表达，经Spearman相关性分析，PDGF-D及MPO在大肠癌组织中的表达呈正相关(r=0.27，P ＜0.05，见表3)。

3 讨论

现已发现，PDGF家族有4个成员:PDGF-A、B、C、D[3]。PDGF-D 对肿瘤的血管形成具有促进作用[4]，肿瘤新生血管的形成在恶性肿瘤的侵袭和转移中起着重要的作用，血管形成的过程受到各种因子的调节。PDGF-D在多种肿瘤中呈现过表达，如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、神经系统肿瘤、黑色素瘤等。大多数细胞因子通过PDGF-D受体的介导，进而激活靶细胞的信号传导通路，从而发挥其功能与作用。近期研究表明，PDGF-D与多种肿瘤的血管形成有关，并在多种肿瘤中都有表达，而在正常组织中不表达或低表达。

MPO是中性粒细胞中嗜天青颗粒经氧化反应后所产生的一种极其重要的过氧化物酶，其主要存在于嗜中性粒细胞和单核细胞中。MPO氧化作用的过度表达被认为与组织损伤和疾病的起始、进展相关。比如，起源于慢性炎症的癌症。同时MPO氧化活性被认为促进了化学致癌物质代谢，导致了DNA损伤和修复过程[5]。Jaganjac等[6]研究表明 MPO 在肿瘤微环境的表达是肿瘤细胞转移后伴随着丙烯醛而出现的，并在肿瘤细胞衰退期间表达增强。研究发现MPO可产生自由基，可有效防止自然杀伤细胞对肿瘤细胞的对抗反应，同时导致受损DNA堆积，这也可能是间接地促进肿瘤细胞的发生和发展的原因之一[7]。

表2 PDGF-D和MPO在大肠癌中的表达与临床病理特征的关系Tab2 The relationship of the expression of PDGF-D and MPO with clinical pathological parameters in the colorectal cancer tissues

表3 PDGF-D和MPO在大肠癌中表达的相关性Tab3 The correlation between expression of PDGF-D and MPO in colorectal cancer tissues

本研究发现，与大肠腺瘤组织比较，MPO主要表达于大肠癌的胞浆中;PDGF-D也主要表达于大肠癌的胞浆中，在胞膜及胞核中也存在着不同程度表达。研究发现PDGF-D可以激活下游的NF-κB信号转导通路促进血管内皮生长因子的上调，从而促进肿瘤血管的形成，并且使肿瘤周围的基质金属蛋白酶的表达升高[8]，为肿瘤的浸润和转移创造必要的条件。据此推测，PDGF-D的高表达可能与大肠癌的淋巴结转移、远处转移密切相关。Spearman相关性分析提示，大肠癌中MPO与PDGF-D呈显著正相关。国内外的研究认为MPO是存在于单核巨嗜细胞和中性粒细胞中的Ⅰ相代谢酶，可代谢激活多种环境致癌物，如多环芳烃类、亚硝基化合物、杂环芳香胺类等，引起DNA损伤而启动细胞癌变[5]。MPO通过增加细胞内钙离子水平及消耗细胞内能量物质来诱导细胞的凋亡，而PDGFD对肿瘤的血管形成具有促进作用，因此，两者共同作用能够促进大肠癌的发生、发展，联合检测PDGF-D及MPO在肿瘤患者体内的表达，将有助于评估恶性肿瘤侵袭、转移风险，评估手术患者治疗预后，有可能成为肿瘤细胞浸润及转移能力的重要临床生化评估指标之一。

[1]Schabath MB，Spitz MR，Zhang X，et al.Genetic variants of myeloperoxidase and lung cancer riskp [J].Carcinogenesis，2008，21(6):1163-1166.

[2]Wang Z，Kong D，LiY，et al.PDGF-D signaling:A novel target in cancer therapy[J].Curr Drug Targets，2009，10(1):38-41.

[3]Andrae J，Gallini R，Betsholtz C.Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine[J].Genes Dev，2008，22(10):1276-1312.

[4]Wang Z，Kong D，Banerjee S，et al.Down-regulation of plateletderived growth factor-D inhibits cell growth and angiogenesis through inactivation of Notch-1 and nuclear factor-κB signaling [J].Cancer Res，2007，67(23):11377-11385.

[5]Mika D，Guruvayoorappan C.Myeloperoxidase:the yin and yang in tumour progression [J].J Exp Ther Oncol，2011，9(2):93-100.

[6]Jaganjac M，Poljak-Blazi M，Schaur RJ，et al.Elevated neutrophil elastase and acrolein-protein adducts are associated with W256 regression [J].Clin Exp Immunol，2012，170(2):178-185.

[7]Branniqan AE，O’Commell PR，Hurley H，et al.Neutrophil apoptosis is delayed in patient with inflammatory bowel disease[J].Shock，2009，13(5):361-366.

[8]Sun Y，Yang F，Yan J，et al.New anti-fibrotic mechanisms ofN-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline in silicon dioxide-induced ilicosis[J].Life Sci，2010，87(7-8):232-239.