β重型地中海贫血儿童NK细胞频率及杀伤活性

鲍俊杰 邹 勇 陈小红 张白杜

1.广州市妇女儿童医疗中心检验科，广东广州 510180；2.中山大学附属第三医院输血科，广东广州 510630

同种异体输血可导致免疫功能抑制，一旦发生免疫抑制，人体更易受到细菌、病毒和肿瘤的侵袭，临床上通常表现为术后较高的细菌感染发生率和恶性肿瘤复发率[1-3]。目前关于同种异体输血导致的免疫抑制的机制仍不明确，已有报道显示同种异体输血能够抑制自然杀伤（NK）细胞的功能[4-8]。本研究通过分析β重型地中海贫血儿童NK细胞的表达频率及杀伤活性，旨在探讨长期输血对β重型地中海贫血儿童NK细胞细胞频率及杀伤活性的影响，为重型β地中海贫血儿童临床免疫监测和治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2011年1月～2013年12月在广州市妇女儿童医疗中心及中山大学附属第三医院进行输血治疗长达3年的β重型地中海贫血儿童20例为β重型地中海贫血组，其中男13例，女7例，年龄（9.90±4.87）岁。排除贫血以外的其他疾病如细菌、病毒性感染、肿瘤等。选取同期同龄健康体检儿童20例作为对照组，男 11例，女 9例，年龄（10.80±5.92）岁。 所有患者及患者家属均知情同意。

1.2 仪器与试剂

BD LSRⅡ流式细胞仪 （美国BD公司），FITC标记的鼠抗人CD3、APC标记的鼠抗人CD56、PE标记的鼠抗人CD107a、鼠抗人lgG1同型对照抗体、红细胞裂解液、阻断剂GolgiStop均购自美国BD公司；刺激剂佛波酯（PMA）、钙离子导入剂伊屋诺霉素（Ionomycin）购自美国Sigma公司，人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物。

1.3 研究方法

1.3.1 NK细胞比例分析 取100 μL无菌外周抗凝血，加入FITC标记的鼠抗人CD3、APC标记的鼠抗人CD56单克隆抗体各20 μL,室温闭光孵育30 min，红细胞裂解液室温裂解15 min后用流式缓冲液离心洗涤两次，500 μL流式缓冲液重悬，流式细胞仪检测。

1.3.2 NK细胞CD107a表达分析 密度梯度离心无菌分离外周血单个核细胞 （PBMC）,将PBMC用完全1640培养基调整细胞浓度至1×106个/mL，置于24孔板，加入刺激剂 PMA（20 ng/mL），Ionomycin（1 μg/mL），PE标记的鼠抗人CD107a或同型对照抗体20 μL。1 h避光刺激后加入阻断剂GolgiStop，继续孵育5 h。加入FITC标记的鼠抗人CD3、APC标记的鼠抗人CD56单克隆抗体各20 μL,室温闭光孵育30 min后用流式缓冲液离心洗涤2次，500 μL流式缓冲液重悬， 流式细胞仪检测 NK细胞 （CD3－CD56+） 表面CD107a表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验。非正态分布的计量资料用中位数（M）及四分位数（P25，P75）表示，采用秩和检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NK细胞细胞频率

结果显示：与对照组比较，β重型地中海贫血组外周血 NK 细胞频率显著减少[（4.5±2.8）%比（12.0±4.0）%]，差异有统高度计学意义（P=0.000）。 见图 1。

2.2 NK细胞杀伤活性（CD107a）表达

图1 NK细胞细胞频率图

结果显示：β重型地中海贫血组外周血NK细胞表面 CD107a表达频率为（23.9±7.4）%，对照组为（51.4±11.9）%，β重型地中海贫血组外周血NK细胞的杀伤活性显著低于对照组，差异有统高度计学意义 （P=0.000）。 见图 2。

3 讨论

β地中海贫血是我国华南一带尤其在广西、广东省发病率最高危害最大的遗传病之一[9]。2007年的一项不完全统计显示，广州市β地中海贫血的发生率为11.26%，其中β地中海贫血（轻型，中间型）发生率为10.0%，β重型地中海贫血发生率为1.26%[10]。重型地中海贫血患儿的出生和地中海贫血基因的蔓延，已经严重影响了人口出生的质量，为社会和家庭带来了沉重的经济和心理负担。

图2 NK细胞杀伤活性（CD107a）表达分析图

重型β地中海贫血的儿童需要以每3～4周1次的频率接受长期的输血治疗才能维持生命，然而长期的贫血状态以及大量输血增加了机体铁负荷，常导致患者自身免疫功能低下，易引起呼吸道感染等各种并发症及脏器功能损害、寿命缩短等[11-12]。大量研究已经证实同种异体输血可以导致免疫功能的抑制，而且许多学者认为，输血诱导的免疫抑制是多种机制共同作用的结果。目前关于输血导致的免疫抑制的机制仍不能确定，已经报道的有以下几种：①同种异体输血刺激了受血者的免疫系统，使Th1反应（细胞免疫）下调，Th2反应（体液免疫）上调[13]；②患者输入的异体血中单核细胞分泌的前列腺素 E2（PGE2）增加[14]，PGE2有强烈的免疫抑制作用，减少了巨噬细胞HLA-Ⅱ类抗原的表达，抑制了白介素-2（IL-2）的产生，使得靶细胞对IL-2的反应性下降，Th1反应 （细胞免疫）下调，自然杀伤细胞（NK）活性下降，B细胞产生抗体的水平下调；③输血能够抑制NK细胞的功能。因此本研究组也推测长期输血的β重型地中海贫血儿童的固有免疫系统特别是NK的功能可能受到了抑制。

本研究分析了β重型地中海贫血组NK细胞（CD3－CD56+） 的表达频率及杀伤活性 （CD107a表达），发现其外周血NK细胞频率及杀伤活性均显著低于对照组，此可能与输血诱导的NK细胞免疫抑制相关，其机制有待进一步深入研究。目前本研究组推测可能的NK细胞免疫抑制的分子机制有：①长期输血导致调节性T细胞（CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD8+Treg）的抑制功能增强，分泌的IL-10和TGF-β增加，NK细胞功能受到抑制；②悬浮红细胞在保存过程中由于白细胞的崩解，产生的可溶性HLA-Ⅰ类抗原、FasL和TGF-β的产物增加，输注后对NK细胞的功能起到一定的抑制作用；③异体血中的活性物质如PGE2、TGF-β、IL-10等或可溶性免疫介质HLA-Ⅰ类抗原、FasL等诱使受血者NK细胞表面NK细胞受体表达紊乱，活化型受体表达下调或抑制型受体上调，导致NK细胞传导的抑制信号占优，NK细胞功能受到抑制。总之，进一步研究长期输血β地中海贫血儿童输血诱导的NK细胞免疫抑制的分子机制是下一步工作的重点，此将为β地中海贫血儿童临床免疫监测和免疫干预治疗提供重要的分子靶点和理论基础。

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