HPLC法测定喉咽清口服液中齐墩果酸的含量

谢 谊 李跃辉 唐纯玉 唐代凤 刘玉琴，3 曹立云 彭艳梅

1.湖南省中医药研究院杨永华名老中医药专家传承工作室，湖南长沙 410013；2.湖南时代阳光药业股份有限公司，湖南永州 425000；3.湖南中医药大学，湖南长沙 410208

喉咽清口服液是由土牛膝、马兰草、车前草、天名精四味中药提取制成的中药口服液，为湖南时代阳光药业股份有限公司自主研制开发的国家级新药，是全国独家产品，其中土牛膝为该制剂的君药，别名倒扣草，收载于《湖南省中药材标准》2009年版，为觅科植物土牛膝Achyranthes aspera Linnaeus的干燥根及根茎，性平、微苦、凉，具清热解毒、利咽化痰、抗菌消炎、镇静止痛之功效，临床常用于白喉、扁桃体炎、急慢性咽喉炎、感冒发烧、麻疹肺炎、痈疽疖肿、蛇咬伤、类风湿关节炎等的治疗[1-4]。据文献报道，喉炎清口服液联合利巴韦林气雾剂治疗儿童急性咽炎效果显著[5]。土牛膝所含化学成分主要为三萜皂苷（苷元为齐墩果酸，如齐墩果酸吡喃鼠李糖基吡喃半乳糖苷、齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）、生物碱（如甜菜碱）、昆虫变态激素（如β-蜕皮甾酮）以及多糖[6]。制剂收载于《中国药典》2010年版一部，含量测定采用双波长薄层色谱扫描的方法，测定土牛膝水解后得到的齐墩果酸的含量，该方法专属性不好，操作复杂。本研究拟用HPLC法测定齐墩果酸的含量，为该制剂的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-10AT高效液相色谱仪，SPD－10AVP紫外可见检测器，岛津Cs-930型双波长薄层扫描仪（日本岛津公司）；N2000双通道色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所）；定量毛细管（美国Drunmand公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；HH系列恒温水浴锅（江苏金坛中大仪器厂）。

1.2 对照品与试药

齐墩果酸对照品（中国食品药品检定研究所，批号：111733-201205，供含量测定用）；喉咽清口服液由企业提供（批号分别为20120922、20121005、20121015、20121113、20130117、20130401、20130412、20130620、20130660、20130901）。

1.3 试剂

硅胶G（青岛海洋化工厂）；甲醇、乙腈为色谱纯；浓盐酸、硫酸为分析纯；乙醇为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

精密量取喉咽清口服液25 mL至50 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，冰箱放置3 h后取出，放至室温，加乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL、盐酸3 mL，置锥形瓶中加热回流 1 h，冷却，转移至分液漏斗中，用石油醚（60～90℃）振摇提取6次，每次20 mL，合并石油醚液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，定量转移至10 mL量瓶中，冷却，加甲醇至刻度，摇匀，滤膜过滤，取续滤液即得[7]。

2.2 对照品溶液的制备

取齐墩果酸对照品9.86 mg，精密称定，置于10 mL的量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得齐墩果酸对照品储备液，浓度为0.986 mg/mL。精密吸取上述对照品储备液适量，用甲醇稀释成浓度为0.493 mg/mL的对照品溶液，即得。

2.3 阴性干扰试验

取除土牛膝外的其他药材，按工艺方法制备，并按供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。

2.4 色谱条件与系统适应性[8-9]

色谱柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（90∶10）；紫外检测波长：210 nm[10]；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：10 μL。 按齐墩果酸峰计算，理论板数应不低于2000。

此条件下待测组分与其他组分达到有效分离；阴性无干扰。对照品、喉咽清口服液供试品及阴性样品色谱图见图1。

2.5 线性关系的考察

精密吸取齐墩果酸对照品储备液（0.986 mg/mL）1、2、4、6、8、10 μL，按照前述色谱条件分别进样测定，记录各进样量下的色谱峰面积，以峰面积积分值Y对进样量X（μg）进行线性回归，得齐墩果酸的线性回归方程为：Y=2.42×103X+5.31×104，r=0.9997，齐墩果酸在0.986～9.860 μg线性范围内与峰面积呈良好线性关系。

图1 各溶液高效液相色谱图

2.6 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液（批号：20130620），按照前述色谱条件，连续进样6次测定，记录各次峰面积。结果得齐墩果酸峰面积的RSD为0.96%，表明本方法精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一批号样品（批号：20130620），按照“2.1”项下操作制备供试品溶液，按照前述色谱条件，分别于0、2、4、8、10 h 精密吸取该供试品溶液 10 μL 进样测定，记录各次峰面积，计算得齐墩果酸峰面积的RSD为0.44%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.8 重复性试验

取同一批号样品（批号：20130620）6 份，按照“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，精密吸取各份溶液10 μL，注入液相色谱仪，按外标法计算齐墩果酸的含量。6份样品中齐墩果酸的平均含量为0.242 mg/mL，RSD为1.92%，表明方法的重复性良好。

2.9 加样回收试验

精密量取已知含量的同一批号（批号：20130620）样品6份，每份10 mL，醇沉准备酸水解时，再精密加入齐墩果酸对照品适量，按照“2.2”项下操作分别平行制备6份供试品溶液。精密吸取各溶液10 μL，按照前述色谱条件分别进样测定，记录色谱峰面积，计算回收率，结果见表1。

表1 齐墩果酸加样回收率试验（n=6）

2.10 样品测定

取10样品进行含量测定，按“2.1”项下操作，进样，计算齐墩果酸的含量，结果见表2。

表2 10批喉咽清口服液中齐墩果酸的含量测定结果（mg/mL，n=2）

2.11 薄层扫描色谱法[11]

2.11.1 色谱条件 展开剂为环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（20∶5∶8）；显色剂为 10%硫酸乙醇溶液；扫描波长λS=520 nm，λR=700 nm。

2.11.2 供试品溶液的制备 精密量取本品25 mL，用水饱和的正丁醇振摇提取6次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加乙醇30 mL、盐酸3 mL使溶解，加热回流提取1 h，提取液回收乙醇至无醇味，加水30 mL，用石油醚（60～90℃）振摇提取 6次，每次20 mL，合并石油醚液，置水浴上蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，定量转移至5 mL量瓶中，冷却，加无水乙醇刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.11.3 对照品溶液的制备 方法与“2.2”项下同。

2.11.4 线性关系考察 精密吸取齐墩果酸对照品储备液（0.986 mg/mL）2、4、6、8、10 μL 点于同一硅胶 G 薄层板上，展开，晾干，喷以 10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，晾干，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，按照上述色谱条件进行扫描，测定峰面积积分值。以齐墩果酸含量X（μg）为横坐标，以吸收度积分值Y为纵坐标，计算回归方程Y＝4572.1X-508.7，r＝ 0.9991，线性范围为：1.97～9.86 μg。

2.11.5 样品测定 分别吸取各供试品溶液3、6 μL、对照品溶液2、4 μL，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，展开、扫描，测量供试品与对照品吸收度积分值，测定，计算，即得。色谱图见图2。

图2 齐墩果酸薄层色谱扫描图

3 讨论

3.1 样品处理方法的选择

原标准是采用正丁醇振摇提取口服液中的齐墩果烷类三萜皂苷成分，操作繁琐，而且冬天气温低，样品溶液容易乳化难以分层，为操作带来不便，本研究改为醇沉除去杂质保留有效成分，简化了操作。考察了试验过程中硫酸、盐酸酸水解时间[12]，结果盐酸水解1 h较完全。

3.2 流动相的筛选

本实验对甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸、乙腈-水这三种流动相系统进行了比较筛选，结果发现以甲醇-水系统无论怎样调节两者比例均未得良好峰形的峰，而换用乙腈-水流动相即可得到满意的色谱峰形，齐墩果酸与其他杂质峰的分离度也较高。

3.3 紫外测定波长的选择

采用二极管阵列检测器在190～380 nm范围内分别扫描齐墩果酸峰的紫外吸收，齐墩果酸在204 nm波长处有最大吸收，但由于甲醇的截止波长为205 nm，选用此波长来检测时溶剂有吸收，对测定造成干扰，故选用210 nm作为测定波长，以保证测定结果的准确性。

3.4 样品含量结果分析

采用高效液相色谱法和薄层扫描法两种方法，对企业提供的10批喉咽清口服液进行齐墩果酸含量测定，结果同一厂家不同批次间的含量差异不明显，但是两种方法测定的结果差异很大。《中国药典》（2010年版）采用双波长薄层色谱扫描的方法，测定口服液中土牛膝水解后得到的齐墩果酸的含量，薄层扫描方法专属性不好，结果可受薄层板吸附剂的性能及薄层质量、斑点分离情况、显色情况等多种因素的影响[13-15]，测定结果的重复性不是很好；齐墩果酸在加入显色剂后，要尽可能在半小时内测定，以免误差大[12]。而本文建立了RP-HPLC测定喉咽清口服液中齐墩果酸含量的方法，操作简便，测定结果准确，方法重复性好，可作为喉咽清口服液质量控制的有效方法。

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