药敏试验在鱼病防治中的应用

仲崇艳

（滁州市水产研究所，安徽 滁州 239074）

随着水产养殖业的不断发展，养殖密度增大、水质环境恶化和其它多种原因导致细菌性疾病日益增多。由于养殖户缺乏对鱼病的正确认识而滥用药物，增加了细菌的耐药性，使得抗菌药对细菌性疾病的防治效果不理想，不但造成药物浪费，而且延误病情。对疾病做出正确诊断，对症下药，对致病菌做药敏试验是最科学的方法。按照传统方法进行细菌鉴定和药敏试验，至少需1周～2周时间。对养殖户来说，一旦鱼发生病害，应及时防治，减少损失。

测定抗菌药物在体外对微生物有无抵制作用的方法称为药物敏感性试验，简称药敏试验。KB法，即通常所说的纸片扩散药敏试验，是目前临床上最常用的药敏试验方法。其技术上简单易行，重复性好;试验成本相对较低，不需要特殊设备;抗菌药物的选择有很大的灵活性;药敏结果解释性分类（S、I、R）易理解［1］。经典的药敏试验选择的是M-H培养基［1］，也有选择肉膏-胰胨培养基［2］，而关于LB培养基应用于药敏试验鲜有报告。以鳊为例就LB培养基应用于药敏试验（K-B法）进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

LB液体培养基［2］:蛋白胨1%，酵母膏1%，氯化钠0.5%，pH值7.2;121℃20min。LB固体培养基是在LB液体培养基的基础上加入1.5%～2.0%的琼脂，121℃20min。

1.1.2 药敏试纸

购自杭州微生物试剂有限公司（执行标准:WS/T125-1999）

1.1.3 0.5 麦氏标准浊度［1］

将0.5mL0.048moL/L的BaCl2（1.175%W/VBaCl2·2H2O）加入到 99.5mL0.18moL/L的H2SO4（1%W/V）中并不断搅动，以维持混悬状态。

1.1.4 病鱼

取自安徽滁州市某水库急性发病的鳊（非缺氧、机械损伤，中毒与药害导致的死亡）。

1.2 方法

1.2.1 LB药敏平板的制作

将灭过菌的LB固体培养基放在无菌操作台中，当培养基冷却到60℃左右时，倒平板（90mm培养皿，每皿注入培养基约20 mL）晾干备用。

1.2.2 麦氏标准管的制作［1］

0.5麦氏比浊管相对的菌数为1.5×109CFU/mL，为标准参照物，直接购买或配制（1%Bacl20.5 mL，1%H2SO49.5 mL）。

1.2.3 K-B纸片法的具体步骤

按国家标准执行［1］。

1.2.4 直接药敏试验（又称一步法药敏试验）［4］

用70%的酒精棉球擦拭病鱼体表，用消毒过的解剖剪，分别取肝脏和肾脏等组织匀浆液0.2mL涂药敏平板，按K-B纸片法的具体步骤做药验试验。

1.2.5 富集培养药敏法（增菌培养后再作药敏）

将鳊病变的肾脏与肝脏组织匀浆液接种到装有LB液体培养基的试管或离心管中，36±1℃恒温培养箱中培养4～9h进行增菌培养后做药敏试验。

1.2.6 致病菌纯培养后的药敏试验

通过稀释法，将纯培养后致病菌液的浓度调整到0.5麦氏比浊管浓度（细菌浓度约为1.5×108/mL）;取0.2mL涂药敏平板，按K-B纸片法的具体步骤做药敏试验。

1.2.7 抑菌试验结果的判断标准

根据试验抑菌圈结果，并针对不同的抗生素、菌株参考NCCLS标准或CSLI标准，做出判断。

2 试验结果

2.1 直接法药敏试验结果

见表1。

表1 直接法药敏试验结果

2.2 富集法培养药敏试验结果

见表2。

表2 富集法培养药敏试验结果

2.3 致病菌纯培养后药敏结果

见表3。

表3 致病菌纯培养后药敏结果

3 讨论

以LB培养基为基础，通过用直接法、富集法、致病菌纯培养后3种方法进行药敏试验，结果发现:这3种方法试验结果无显著差异，在实践中可根据需要灵活运用。根据农业部《无公害食品渔药药物使用准则》中规定环丙氟派酸等药物属于禁止用渔药，可选择其他几种药物使用。本试验选用了药物中的诺氟沙星拌料投喂后两天便控制了病情，效果显著。

耐药菌株的产生是鱼病防治的一大难题，临床准确用药，快速的药敏报告是前提基础。该技术简单易行，不需要特殊的仪器设备，重复性好［1］。对指导鱼类病害防治，降低用药成本，有重要作用，可积极推广。

［1］倪语星，王金良，徐英春，等.抗微生物药物敏感性试验规范［M］.上海科学技术出版社:17-26.

［2］周德庆，微生物实验教程（第2版）［M］:2006.3.

［3］廖诗英，张世卿.鸡大肠杆菌TTC快速药敏试验方法的研究［J］.江苏农业科学，2009（5）;206.

［4］崔晨光，崔彦刚，邵素云.一步法药敏试验在临床诊断上的应用［J］.今日畜牧兽医，2010（1）.

［5］李先斌，莫丽亚，赵蕊，等.用显色半固体进行快速细菌药敏试验的方法［J］.实用预防医学，2006.13.（2）;443-444.

［6］陈淑兰，宋熙瑶，董娟，刘文博，赵金英.控制影响细菌药敏试验（K-B法）质量的各因素［J］.哈尔滨医科大学报，1999年（2），157-158.