一例肥猪“猝死征”的病原分离与分析

邬向东，陶明华，陈如圣，陶明江，张祥华，陈瑞光

（1.江西农业大学动科院，江西 南昌 330045；2.上海海利生物技术股份有限公司）

猪猝死征主要是由魏氏梭菌混合其它细菌共同引起的一种急性死亡症。魏氏梭菌广泛存在人畜粪便、土壤、水等环境中，该菌群属典型的条件性致病菌，它可引发地区性流行病，每年都有大量的动物因不同类型魏氏梭菌感染而死亡。尤其是近年来我国发生家畜猝死征与该菌有关，发病急、病程短、无任何前期症状而突然死亡，而且死亡率极高。一般发生于育肥猪、母猪，呈散发性流行。

2013年12月，江西农业大学兽医院接诊一例育肥急性死亡病例，表现为100kg左右的育肥猪突然死亡，死后口鼻流出带血的泡沫状液体。当地兽医诊断为传染性胸膜肺炎，但治疗效果不理想，转到兽医院检测，诊断为“猝死征”，病原分离得到两株细菌，分别为大肠杆菌(JXV-E1203)和魏氏梭菌(JXV-C1203)，根据检测结果针对性用药，疫情得到控制，现将病原分离与分析情况介绍如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料。某猪场送来的3头急性死亡肥猪，剖检后采集肝脏、脾脏、心血、肠内容物为细菌分离病料。

1.1.2 主要试剂、培养基。革兰氏染色液、鲜血培养基、牛奶培养基、麦氏比浊管等参照文献自行配制；药敏纸片。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养。在超净工作台中，以无菌操作，用接种环从病料中钩菌，划线接种于鲜血培养基进行需氧培养；另采肠道和肝微生物接种于石蕊牛乳培养基，80℃处理30min后，进行厌氧培养。

1.2.1.1 需氧培养。将接种细菌的鲜血培养基，置37℃普通大气环境中，于恒温箱中恒温培养24～48h，观察有无可疑菌落生长，并记录结果。

1.2.1.2 厌氧培养。将接种细菌的石蕊牛乳培养基置37℃培养18～24h，观察有无“暴烈发酵”现象，如有，从试管中钩菌接种鲜血培养基，置厌氧缸中37℃厌氧培养24～48h，观察有无可疑菌落生长。

1.2.2 细菌生化鉴定。参照文献进行操作，将分离纯化的菌株JXV-E1203，分别接种糖发酵微量发酵管、蛋白胨水、糖葡萄蛋白水、柠檬酸盐利用发酵管，37℃培养24～48h观察糖发酵管颜色变化，同时进行V-P试验、M-R试验、吲哚试验检测，观察结果。

表1 JXV-E1203攻毒小鼠分组及试验结果 只，mL，%

1.2.3 细菌小鼠攻毒（见表1）。将需氧分离纯化革兰氏阴性菌株（JXV-E1203）接种鲜血培养基37℃恒温静置培养18h，加无菌生理盐水，将菌苔刮至生理盐水中获得菌悬液，再将菌液与麦氏比浊管比较，估算菌数后稀释为3×108CFU/mL，作为小鼠攻毒试用菌液。

随机选择6只相同小鼠，随机分为3组，每组两只，将攻毒菌液分别稀释成3×108CFU/mL和3×107CFU/mL两个浓度进行分别攻毒，每只皮下注射0.1mL。对照组小鼠每只皮下注射生理盐水0.1mL。攻毒后3组给予同样的饲养环境，每天观察记录发病及死亡情况，连续观察一周。死亡小鼠及时剖检，用肝脏重新分离细菌。

2 试验结果

2.1 细菌分离结果

分离菌株JXV-E1203在普通大气环境下37℃培养24h，生长良好，形成中等大小、光滑、湿润、边缘整齐、水滴样菌落，呈明显β溶血（图1）。

图2 JXV-C1203厌氧培养呈双溶血环

分离菌株JXV-C1203在石蕊牛乳培养基置37℃培养18h呈“暴烈发酵”，在厌氧缸无氧环境下37℃培养24h后，可见细菌生长良好，形成直径2～5mm、表面光滑、半透明的菌落，菌落周围有双溶血环（见图2）。

2.2 细菌染色镜检结果

将需氧分离到的菌株JXV-E1203进行革兰氏染色，发现细菌呈球杆状菌，两端钝圆，中等大小，单个存在，有时成双排列，革兰氏染色阴性（见图3）。

图3 需氧分离菌株革兰氏染色结果

将无氧分离到的菌株JXV-C1203进行革兰氏染色，菌体呈粗大直杆状，两端钝圆，单在或成双排列，革兰染色阳性（见图4）。

图4 厌氧分离菌株革兰氏染色结果

2.3 细菌生化鉴定结果

普通大气分离菌株JXV-E1203，接种微量生化发酵管，结果该菌能分解葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、木糖，不分解鼠李糖、杨苷；V-P试验阴性、M-R试验阳性、吲哚试验阳性，初步鉴定为大肠杆菌。

2.4 细菌小鼠攻毒结果

小鼠攻毒结果见表1。高低剂量两组试验组小鼠分别在第3、4d全部死亡，死亡小鼠均表现肛门出血（见图5）。

图5 死亡小鼠肛门出血

剖解可见小鼠表面严重的败血变化，肝脏、肾脏坏死出血，脾脏出血，整个肠道充满带血的粘液，肠道出血严重（见图6）。

图6 剖小鼠内脏出血、肠充血

3 小结与讨论

3.1 本病例经临床症状观察、病理剖检初诊为育肥猪的“猝死征”，通过需氧和厌氧细菌分离，分离鉴定出两株细菌，分别命名为JXV-E1203、JXVC1203。JXV-E1203经生化鉴定为大肠杆菌，小鼠攻毒具有较强的毒力，每只小鼠攻毒3×106CFU/只，即可至死；而且死亡小鼠均表现出肠道出血。厌氧分离菌株JXV-C1203在牛奶培养基培养表现出“暴烈发酵”现象，在血平板上厌氧培养呈双溶环血环，为革兰氏阳性大杆菌，初步判断为魏氏梭菌。JXVC1203虽未做攻毒试验，但其溶血十分严重，可能也有致病力。

3.2 “肥猪猝死征”是一种病原较复杂的疾病，其病因与应激相关，病原相对复杂，一般认为与魏氏梭菌相关，但常有其它细菌混合感染。本次试验发现出血变化是其特征，病原分离得到魏氏梭菌和大肠杆菌，这与以往报道主要是魏氏梭菌与巴氏杆菌混合感染有所不同。

该病目前虽不是常见病，但来势凶猛，常发于成年动物，损失也比较严重。临床表现出症状后难以治疗，且死亡率很高，应引起养殖户和兽医技术人员的重视。魏氏梭菌常与其它菌混合感染，如临床上已分离到巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌，但也有单独感染的。

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