知柏地黄汤对解脲支原体感染大鼠生精细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的影响

郭军华 ，李迎秋 ，郭炫佐 ，刘朝圣 ，何清湖 *

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.江苏盐城市中医院，江苏 盐城 224002）

知柏地黄汤对解脲支原体感染大鼠生精细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的影响

郭军华1，2，李迎秋1，郭炫佐1，刘朝圣1，何清湖1*

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.江苏盐城市中医院，江苏 盐城 224002）

目的探讨知柏地黄汤对解脲支原体（ureaplasma urealyticum，UU）感染大鼠生精细胞线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)的影响。方法将40只SD雄性大鼠，随机分成正常组和造模组，采用经膀胱注射UU标准株悬液接种，建立UU感染动物模型，再将造模成功的大鼠随机分为模型组、阿奇霉素组（西药组）、知柏地黄汤组（中药组）。采用彩色精子动态检测系统检测精子运动参数；ELISA方法检测SDH的活性及含量；RT-PCR法检测SDH mRNA表达。结果与正常组比较，模型组大鼠精子活力、SDH活性和含量以及SDH mRNA表达均明显降低（P<0.01）。与模型组比较，中药组和西药组精子活力及SDH含量均提高（P<0.05，P<0.01），中药组SDH活性提高（P<0.01），西药组SDH mRNA表达提高（P<0.05）。中药组在提高精子运动参数方面效果优于西药组（P<0.05，P<0.01）。结论知柏地黄汤改善UU感染大鼠精子活力的效果优于阿奇霉素，可能通过升高SDH活性与含量来达到提高精子活力的作用。

精子活力低下；解脲支原体；琥珀酸脱氢酶；知柏地黄汤；mRNA表达

根据世界卫生组织调查显示，不孕不育已成为21世纪继肿瘤和心脑血管病之后的第三大疾病。由于环境污染，不洁性行为，日夜颠倒的不良生活习惯等因素的影响，人类的生育能力呈逐年下降趋势，不育症已成为常见疾病之一。感染已上升为引起不育症的第一因素[1]。其中15%的男性不育与生殖道感染有关，而解脲支原体的感染率最高[2]。许多研究表明解脲支原体 （ureaplasma urealyticum，UU）感染能够从多方面导致男性不育，如降低精液质量、引起免疫性不育、改变精液中微量元素以及影响细胞因子等等[3]。精子运动能力所需要的能量ATP来源于线粒体的呼吸功能，而琥珀酸脱氢酶(SDH)作为线粒体呼吸功能的限速酶之一，故本研究从线粒体呼吸功能方面进行探讨，为知柏地黄汤治疗UU感染所致的精子活力低下症提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体（SPF）级SD 4～5月龄雄性大鼠，体质量（200±20）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(湘)2011-0003。

1.1.2 药物 知柏地黄汤：药物组成、炮制及用量参照 《医宗金鉴》所载执行 [熟地黄24 g，山茱萸12 g，山药 12 g，泽泻 9 g，牡丹皮 9 g，茯苓(不去皮)9 g，盐知母6 g，盐黄柏9 g]。按以上比例由湖南中医药大学附属医林药号提供950 g药材。先加蒸馏水浸泡30 min，水煎煮2次，每次30 min，2次煎所得滤液混合后浓缩，生药含量为1 g/mL，于4℃冰箱中保存备用。阿奇霉素（阿奇霉素片，维宏）石药集团欧意药业有限公司生产，规格：0.25 g/片，批号：001120941，临用时用注射用水配成含阿奇霉素25 mg／mL浓度的混悬液。

1.1.3 主要试剂及仪器 UU标准株由南华大学微生物学教研室提供；彩色精子动态检测系统（WLJY-9000，北京伟力新世纪科技发展有限公司）；SDH酶联免疫分析；ELISA试剂盒（博士德，中国）；RT-PCR引物均由上海基尔顿生物公司设计合成。

1.2 方法

1.2.1 UU效价滴定 将UU标准菌株 (冻干品)复苏，于无菌条件下将UU标准菌接种于UU液体培养基中，37℃培养16～24 h，取对数生长期菌体，培养基出现橙红色清亮菌液时进行倍比稀释，接种。体外实验用效价为5×106ccu/mL的菌液颜色变化单位。

1.2.2 造模[4]及评价 4～5月龄SD大鼠 40只，随机抽取30只，经膀胱注射UU标准株悬液接种，建立UU感染动物模型，余下10只注射生理盐水。于接种后的第7天取睾丸穿刺液运用培养法检测UU，判断造模成功否。

1.2.3 分组与给药 将40只SD雄性大鼠，随机抽取30只，建立UU睾丸感染动物模型，再随机分成模型组、阿奇霉素组（西药组）、知柏地黄汤组（中药组），每组10只。剩余10只同步设为正常组。于动物接种的第10天，正常组、模型组灌胃给生理盐水。治疗组灌胃给相应药物。给药剂量按动物每公斤体质量占人体表面积的比值计算，知柏地黄汤组给药量为 7.8 g/（kg·d），阿奇霉素组给药量为 0.105 g/（kg·d）。各组均连续灌胃21 d。

1.3 观察指标及检验方法

1.3.1 精子运动参数检测 采用颈椎脱臼法处死大鼠，取附睾组织，用37℃预温的PBS冲洗1遍，然后将附睾尾放入盛有3 mL 37℃预温的PBS液的培养皿中。用无菌手术刀从附睾尾近侧端至输精管深切4～5刀，避免切口暴露在空气中。避免精子暴露于空气中而死亡。将含精子的培养皿置37℃CO2培养箱中，扩散5 min，用镊子去除残余组织及未充分扩散的精子块，得到精子悬液。用PBS液采用1∶9稀释，轻轻摇晃混匀，用彩色精子动态检测系统进行精子运动参数测定。

1.3.2 ELISA检测SDH活性和含量 取大鼠睾丸组织，按照ELISA检测试剂盒操作步骤操作检测SDH活性和含量。

1.3.3 RT-PCR检测SDH mRNA 第21天实验结束后，取大鼠睾丸组织，Trizol法提取总RNA，以总RNA为模版，逆转录得到cDNA。操作步骤均按照说明书进行。20 μL逆转录反应体系配置：5×逆转录buffer 4 μL，oligo （d T）0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，逆转录酶 MmLV 1 μL，DEPC 处理水 10 μL，RNA 模板 4 μL。 反应条件：37 ℃，1 h；95 ℃，5 min；灭活MmLV。 50 μL 扩增体系配置：SYBRGreen Mix 32.5 μL， 上游引物 F 0.5 μL， 下游引物 R 0.5 μL，ddH2O 水 14.5 μL，cDNA 模板 2 μL。扩增条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s， 共 40个循环。采用仪器自带软件分析数据：ABI PRISM 7300 SDS软件分析。

引物序列如下：SDH基因引物 A 5'-ACAAGGCTGGAGATAAAC-3'， 引物 B 5'-TTCGGAAGGTCAAAGTAG-3'；GAPDH基因引物A 5'-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，引物 B 5'-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'。

1.4 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件处理实验数据，实验数据用“±s”表示，符合正态性和方差齐性的数据，采用单因素方差分析，组间比较用LSD法。不符合正态性和方差齐性的数据，采用非参数秩和检验。

2 结果

2.1 各组大鼠精子运动参数比较

与正常组比较，模型组大鼠快速前进精子（A级精子）、缓慢前进精子（B级精子）、直线速度、平均速度，差异有统计学意义（P<0.01）。经治疗后，与模型组比较，中药组和西药组精子运动参数提高，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），而两组均不能提高直线运动水平。中药组在提高精子运动参数方面效果优于西药组，差异有统计学意义 （P<0.05，P<0.01）。结果见表1。

2.2 各组大鼠睾丸组织SDH活性、含量及SDH mRNA的比较

模型组大鼠睾丸组织中SDH活性和含量，均显著低于正常组，差异有统计学意义（P<0.01）。经治疗后，与模型组比较，中药组和西药组均能显著提高SDH含量，差异有统计学意义（P<0.01），中药组能提高SDH活性（P<0.01），但是两组均未能使SDH活性和含量达到正常，与正常组比较（P<0.01）。模型组大鼠睾丸组织SDH mRNA表达低于正常组。经治疗后，西药组能够提高睾丸组织SDH mRNA表达，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

表1 各组大鼠精子运动参数比较 （±s，n=10）

表1 各组大鼠精子运动参数比较 （±s，n=10）

注：与正常组比较△△P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01；与中药组比较#P<0.05，##P<0.01。

组 别正常组模型组中药组西药组剂量 g/（kg·d）— —7.8 0.105 A级精子（%）1.03±0.09 0.07±0.03△△1.11±0.30*0.60±0.19*△△##B级精子（%）2.07±0.52 0.35±0.13△△2.40±0.59*1.32±0.27*△△#直线速度（μm/s）10.95±0.98 6.78±1.05△△12.11±1.62**11.47±1.21*曲线速度（μm/s）42.03±1.35 38.10±7.65 54.30±2.35*△△45.75±1.64*△△##平均速度（μm/s）16.22±1.52 10.05±1.80△△18.40±1.27*△△16.69±1.02*##

表2各组大鼠睾丸组织SDH活性、含量及SDH mRNA比较（±s，n=10）

表2各组大鼠睾丸组织SDH活性、含量及SDH mRNA比较（±s，n=10）

注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比△△P<0.01，△P<0.05。

组 别正常组模型组中药组西药组剂量 g/（kg·d）— —7.8 0.105 SDH活性（IU/mL）SDH含量（pg/mL） SDH mRNA 215.85±9.11 359.20±14.16 3.47±0.53 133.46±5.39** 182.14±7.94** 1.85±0.21*159.22±3.72**△△ 236.88±7.90**△△ 2.92±0.36 149.55±6.03** 249.43±10.38**△△ 3.01±0.43△

3 讨论

Hofmann于1955年最先证实ATP是精子尾部运动的能量来源，Comhaire等人研究认为精子中的ATP水平可以反映出人类精子的受精能力高低[5]。SDH是反映精子能量代谢的关键酶之一，位于精子线粒体内膜和脊上，是精子线粒体的标志酶。SDH是三羧酸循环的限速酶，在三羧酸循环产能中，SDH催化琥珀酸脱氢转变为延胡索酸，脱下的H+最后生成ATP。故SDH与ATP的生成密切相关[6]，可以反映精子能量代谢水平。

现代临床观察可见阿奇霉素对UU具有高敏感性，据大量文献记载，阿奇霉素对UU的敏感性几乎与美满霉素和强力霉素的效果相当，在局部地区阿奇霉素的敏感性成略高趋势，且阿奇霉素的副作用较少，在不做药敏的情况下，阿奇霉素可作为治疗UU的阳性对照药[7]。

知柏地黄汤由六味地黄丸加知母、黄柏而成。主治阴虚火旺而致的骨蒸劳热、虚烦盗汗、腰脊酸痛、遗精等症。近年知柏地黄汤在泌尿生殖系感染、血精、精液不液化症以及不孕不育症的治疗中应用广泛，疗效稳定。前期实验证实，知柏地黄汤能有效抑制UU生长、繁殖，促进受损组织的修复，降低精子畸形率，提高精子活率和精子活力，改善精子质量[4]。本实验研究表明，模型组大鼠A级精子、B级精子、直线速度、平均速度、SDH活性和含量以及SDH mRNA表达均明显低于正常组。经治疗后，中药组和西药组A级精子、B级精子、直线速度、曲线速度、平均速度水平及SDH含量均提高，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），提示知柏地黄汤可能通过提高SDH活性与含量以及SDH mRNA表达来升高精子活力。另中药组能提高SDH活性而不能提高睾丸组织SDH mRNA表达，西药组不能提高SDH活性而能提高睾丸组织SDH mRNA表达，由此可见，SDH mRNA的表达可能和SDH活性无关，可能和SDH的含量有关，两组均不能提高直线运动水平，且两组均未能使SDH活性和含量达到正常，与正常组比较（P<0.01），其原因可能是疗程太短，或者药物浓度不够，有待进一步研究。

[1]戚广崇．重视性传播性疾病引起不育症的防治[J]．中华男科学杂志，2000，1(6)：3.

[2]佟爱华，董 梅，孙敏霞，等．泌尿系感染的病原菌分布及耐药调查[J]．武警医学，2012，23(4)：321-322.

[3]黄 珺，张 钧，宋铁军，等.UU的致病性研究进展[J].浙江中医药大学学报（医学版），2013，42（4）：464-471.

[4]刘朝圣，卢芳国，何清湖，等.知柏地黄汤对解脲支原体感染大鼠生精细胞凋亡及Caspase-3、Caspase-9表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2011，31(9)：1 254-1 258.

[5]Comhaire FH，Vermeulen L，Schoonjans F.Reassessment of the accuracy oftraditionalsperm characteristics and adenosine triphosphate(ATP)in estimating the fertilizing potential of human semen in vivo[J]．Int J Androl，1987（10）：653.

[6]彭淑红，黄丽萍，高小恒，等.寒性中药对大鼠骨骼肌能量代谢相关因子的影响[J].中国中药杂志，2009，34（23）：3 064-3 066.

[7]魏献英.泌尿生殖道UU检测及药敏结果分析 [J].临床医学，2009，29（9）:81.

（本文编辑 贺慧娥）

Effects of Zhibai Dihuang Decoction on Spermatogenic Cell Mitochondrial Succinate Dehydrogenase of Rats Infected by Ureaplasma Urealyticum

GUO Junhua1,2,LI Yingqiu1,GUO Xuanzuo1,LIU Chaosheng1,HE Qinghu1*
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha,Hunan 410208,China；2.Yancheng Hospital of Traditional Chinese Medicine,Yancheng,Jiangsu 224002,China）

ObjectiveThis study was to explore the effects of Zhibai Dihuang Decoction on spermatogenic cell mitochondrial succinate dehydrogenase of rats infected by ureaplasma urealyticum(UU).MethodsThe 40 SD rats were randomly divided into normal control group and model group,their bladders were inoculated with UU suspension to establish the UU infection models.Thensuccessfulmodelrats were randomly divided into modelgroup,the azithromycin group(western medicine group),and Zhibai Dihuang Decoction group(TCM group).Sperm motility parameters were detected by the color sperm dynamic detection system;The activity and content of succinate dehydrogenase(SDH)were tested by ELISA;The expressions of SDH mRNA were detected by RT-PCR method.ResultsThe sperm motility,the activity and content of SDH and the expression ofSDH mRNA in the modelratsare significantly lowerthan the control group(P<0.01).Comparing with the model group,the Rat sperm motility and the content of SDH in western medicine group and TCM group(P<0.05,P<0.01);the SDH in Zhibai Dihuang Decoction group was improved (P<0.01),while SDH mRNA in azithromycin group was improved(P<0.05).Curvilinear velocity and average velocity of Zhibai Dihuang Decoction group were better than azithromycin group(P<0.05,P<0.01).ConclusionThe sperm motility in UU affection rats treated with Zhibai Dihuang Decoction was better than that with azithromycin.Zhibai Dihuang Decoction increase sperm motility maybe through increasing the content and activity of SDH.

asthenospermia;ureaplasma urealyticum； succinate dehydrogenase； Zhibai Dihuang Decoction;mRNA expression

R285.5；R256.56

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.11.001.001.04

2013－08－10

国家自然科学基金资助项目（81373641）；湖南省科技厅资助项目（2011sk3104）；长沙市科技局资助项目（K1301014-31）；湖南省科技计划项目（2012SK31387）。

郭军华，男，医学博士，主要从事中西医结合防治男科病研究。

*何清湖，男，医学博士，博士研究生导师，E-mail：hqh1111@tom.com。