对中国国家药品标准甘草酸单铵盐中有关物质及含量检测方法的改进

赵燕燕，石敏健，刘丽艳，韩媛媛，李杨

（1.河北大学医学实验中心，河北保定 071000；2.河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002）

甘草是重要的传统中药，其主要活性成分为甘草酸.制药业通常将甘草酸制成水溶性的甘草酸盐，如甘草酸单铵盐作为制剂生产的原料药.甘草酸单铵盐主成分是一对差向异构体——18α－甘草酸（18α－glycyrrhizic acid，18α－Gly）和18β－甘草酸（18β－glycyrrhizinic acid，18β－Gly），并含有2个有关物质，分别命名为杂质A和杂质B.18α－Gly和18β－Gly分子式相同，仅在18位H存在构相差异，但其药理作用、不良反应及临床疗效方面存在显著不同［1－5］，近年来，二者的比较研究越来越受到国内外研究者的关注.随着国内外对其作用机制研究的不断深入，使得甘草酸制剂行业取得了很大的发展，甘草酸及其制剂的新药申报日趋增多，多种剂型的甘草酸类药物在国内外纷纷上市，被广泛用于治疗各种急慢性肝炎、支气管炎、艾滋病和癌症，同时具有诱生干扰素及调节细胞免疫等功效.甘草酸单铵盐的医药市场前景非常广阔.但中国药典2010版未收载甘草酸单铵盐原料药或制剂；现行中国国家药品标准（WS1－XG－2002）只收载了甘草酸的相关制剂，且只对其主成分混合物进行了含量检测，未能实现对18α－Gly和18β－Gly的有效分离，也未对有关物质检测及限度问题作出规定，造成其内部质量标准的缺失，因此建立同时分离检测甘草酸制剂主成分异构体及其有关物质的分析方法显得尤为重要.

目前，甘草酸类制剂及其原料药检测方法的研究报道很多，如紫外分光光度法［6－7］、毛细管色谱法［8－9］、气相色谱法［10－12］和高效液相色谱法［13－17］等，但同时实现18α－Gly，18β－Gly、杂质A、杂质B分离检测的研究尚未见文献报道.本实验在参考国内外相关文献的基础之上，考察了甘草酸类制剂及其原料药中主成分和有关物质同时分离检测的色谱条件，对中国国家药品标准（WS1－XG－2002）收载的甘草酸类制剂质量标准方法进行了改进，可用于甘草酸单铵盐原料药和不同剂型制剂中有关物质及含量的检测，为其原料药、制剂以及中药材的质量控制和质量标准的建立提供一定依据.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC－10ATvp高效液相色谱仪（日本岛津公司）、SPD－M10Avp二极管阵列检测器（DAD）、CLASS－VP工作站；超纯化水机（重庆颐洋企业发展有限公司）；AUW120D十万分之一电子分析天平（日本岛津公司）；DELTA－320型酸度计（梅特勒－托利多仪器有限公司）；TGL－16G型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）.

18α－Gly对照品（批号：10B001S，ALPS制药）、18β－Gly对照品（批号：05C11S，ALPS制药）、甘草酸单铵盐杂质A对照品（批号：10B002S，ALPS制药）、甘草酸单铵盐杂质B对照品（批号：10B003S，ALPS制药）、甘草酸单铵盐原料药（批号：10EA，11C8，06802N130，A厂）、复方甘草酸苷片（规格：35mg／片，B厂）、复方甘草酸苷胶囊（规格：35mg／粒，C厂）、复方甘草酸苷注射液（规格：53mg／支，B厂）、注射用复方甘草酸单铵S粉针剂（规格：40mg／支，D厂）.高氯酸铵、氨水、高氯酸、冰醋酸、三乙胺、磷酸均为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯（天津市康科德科技有限公司），水为二次去离子水.

1.2 色谱条件

1.2.1 改进方法的色谱条件

色谱柱：Durashell－C18柱（4.6mm×250mm，5μm），北京艾杰尔科技有限公司；流动相：0.01mol／L高氯酸铵（氨水调节pH至8.20）－甲醇（体积比为48∶52）；流速0.80mL／min；检测波长254nm；柱温50℃；进样量10μL.

1.2.2 中国国家药品标准收载的甘草酸类制剂质量标准中的色谱条件

色谱柱：Durashell－C18柱（4.6mm×250mm，5μm），北京艾杰尔科技有限公司；流动相：0.01mol／L磷酸－乙腈（体积比为62∶38）；流速0.80mL／min；检测波长254nm；柱温35℃，进样量10μL.

1.3 溶液的配制

对照品溶液：精密称定18α－Gly，18β－Gly、杂质A和杂质B对照品适量，分别置于10mL容量瓶中，用体积分数50%甲醇溶解、定容，分别配制成质量浓度为1mg／mL的对照品储备液，于4℃冰箱中保存备用.精密量取适量对照品储备液，置于10mL容量瓶中，用体积分数50%甲醇溶液定容，作为对照品溶液.分别精密量取各对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，用体积分数50%甲醇溶液定容，摇均，作为混合对照品溶液.

原料药供试品溶液：精密称定各甘草酸单铵盐原料药适量，分别置于50mL容量瓶中，加入体积分数50%甲醇溶解、定容，分别配制成质量浓度为1mg／mL的甘草酸单铵盐原料药供试品储备液，于4℃冰箱中保存备用.精密量取上述原料药供试品储备液适量，置于10mL容量瓶中，用体积分数50%甲醇溶液定容，得到质量浓度为50μg／mL原料药供试品溶液.

不同剂型制剂供试品溶液：取片剂20片，去除糖衣，精密称定总质量，求得平均片重，研细.取胶囊剂20粒，精密称定总质量，求得平均粒重，取其内容物混均.精密称定上述片剂、胶囊剂各0.1g，粉针剂0.25g，注射液10mL，分别置于25mL容量瓶中，加入体积分数50%甲醇，超声处理40min，冷却至室温，用体积分数50%甲醇定容，配制成质量浓度约为1mg／mL制剂供试品储备液，于4℃冰箱中保存备用.精密量取制剂供试品储备液0.5mL，分别置于10mL容量瓶中，加入体积分数50%甲醇溶液定容，得到质量浓度为50μg／mL供试品溶液.

2 方法与结果

2.1 系统适应性实验

分别量取复方甘草酸苷片空白辅料溶液、混合对照品溶液、制剂供试品溶液、制剂供试品溶液中加入混合对照品溶液，按照“1.2.1”项色谱条件进样分析，空白辅料溶液（A）、混合对照品溶液（B）、制剂供试品溶液（C）和制剂供试品溶液加入混合对照品（D）改进方法HPLC色谱图见图1.结果表明，4种物质均能有效分离，且空白辅料溶液对测定无干扰.

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系

图1 改进方法的HPLC色谱Fig.1 HPLC chromatograms of improve method

分别精密量取18α－Gly，18β－Gly、杂质A和杂质B对照品储备液适量，用体积分数50%甲醇溶液逐级稀释为100.0，50.0，25.0，10.0，5.0，2.5，1.0，0.5μg／mL系列质量浓度溶液，按照“1.2.1”项色谱条件上机分析，记录色谱图.采用最小二乘法对各物质峰面积（A）与溶液质量浓度（ρ）进行线性回归，18α－Gly，18β－Gly，杂质A和杂质B回归方程分别为：A＝7.090×103ρ＋2.493×103（r＝0.999 9）；A＝7.606×103ρ－5.148×102（r＝0.999 9）；A＝1.289×104ρ－8.416×102（r＝0.999 9）；A＝1.220×104ρ－4.932×103（r＝0.999 9）.结果表明18α－Gly，18β－Gly，杂质A和杂质B均在0.5～1.0×102μg／mL质量浓度内与峰面积呈现良好的线性关系.

2.2.2 检出限

精密量取18α－Gly，18β－Gly、杂质A和杂质B对照品储备液，分别用体积分数50%甲醇溶液逐级稀释，按照“1.2.1”中色谱条件上机分析，记录色谱图.以信噪比为3∶1的浓度确定其检出限，18α－Gly，18β－Gly，杂质A和杂质B检出限分别为0.1，0.1，0.15，0.15μg／mL.

2.2.3 精密度

精密吸取“1.3”中混合对照品溶液，按照“1.2.1”色谱条件，连续进样6次，4种待测物峰面积的RSD为0.4%～1.0%（n＝6）.

2.2.4 重现性

精密吸取复方甘草酸苷注射液溶液6份，按“1.3”方法制备供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件进行分析，4种待测物峰面积的RSD为1.2%～1.7%（n＝6）.

2.2.5 稳定性

精密吸取“1.3”复方甘草酸苷注射液供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件，分别在0，1，3，5，7，10d时进行测定.4种待测物峰面积的RSD为0.7%～1.9%（n＝6），结果表明，供试品溶液在10d内检测稳定性良好.

2.2.6 回收率

精密称定复方甘草酸苷片0.05g、复方甘草酸苷胶囊0.05g、注射用复方甘草酸单铵S粉针剂0.125g，精密量取复方甘草酸苷注射液5mL，每种剂型各6份，分别加入适量18α－Gly，18β－Gly，杂质A和杂质B对照

品，按“1.3”方法制备供试品溶液，按照“1.2.1”色谱条件上机分析.加样回收率见表1.

表1 甘草酸不同剂型制剂中主成分及其有关物质的加样回收率（n＝6）Tab.1 Recovery studies of principal component and related substances of different dosage form of glycyrrhizin preparations（n＝6）

2.3 改进方法与中国国家药品标准方法测定结果比较

取对照品溶液，按照“1.2.1”色谱条件上机分析，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25%.分别取3批次原料药和制剂供试品溶液，按“1.2.1”和“1.2.2”色谱条件上机分析，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，分别计算几种待测物的含量.改进方法测定结果及改进方法与中国国家药品标准方法对甘草酸总含量测定结果的比较见表2，改进方法色谱图见图1，标准检测方法色谱图见图2.

结果表明，中国国家药品标准中收载的质量标准，只能检测18α－Gly和18β－Gly的总含量，不能实现对异构体的有效分离，没有对有关物质检测及限度问题作出明确规定；本实验改进的方法，能够在单一流动相、单流速、等度洗脱条件下同时分离甘草酸单铵盐原料药及其制剂中18α－Gly，18β－Gly，杂质A和杂质B，并能检测4种待测物的准确含量.由表2可知，2种方法对甘草酸主成分总含量的测定结果无显著性差异（P＞0.05），说明改进方法准确性良好，可用于甘草酸单铵盐原料药和制剂中甘草酸差向异构体及有关物质的含量测定，为其原料药、制剂以及中药材的质量控制和质量标准的建立提供一定依据.

表2 甘草酸单铵盐原料药及不同剂型制剂有关物质含量改进方法测定结果及与中国国家药品标准方法对甘草酸总含量测定结果的比较（n＝3）Tab.2 Results of determination of related substances in raw material drug of ammonium glycyrrhizinate and different dosage form of glycyrrhizin preparations from the improve method and comparison of determination results of the total glycyrrhizic acid from the improve method and the detection method in national drug standards of China（n＝3）

图2 采用中国国家药品标准收载的甘草酸单铵盐质量标准方法得到的HPLC色谱Fig.2 HPLC chromatogram of raw material drug of ammonium glycyrrhizinate from the detection method in the national drug standards of China

3 讨论

3.1 流动相的选择

实验分别考察了流动相中有机相（乙腈和甲醇）、盐或酸的种类及浓度（冰醋酸、高氯酸、高氯酸铵、磷酸和磷酸盐缓冲液）对异构体和有关物质的分离效果、灵敏度和保留时间的影响.结果表明，以0.010mol／L高氯酸铵－甲醇为流动相时，效果最佳.

实验考察了流动相pH（6.45～8.93）对4种待测物色谱峰的分离度、灵敏度以及保留时间的影响（见图3－A）.结果表明，在pH≥7的条件下方能实现对异构体的同时分离.但在中国国家药品标准（WS1－XG－2002）中，流动相为酸性体系，对18α－Gly，18β－Gly没有分离选择性（图2）.兼顾分离度和灵敏度的要求，选择pH值为8.20.

实验考察了流动相中高氯酸铵浓度（0.005～0.100mol／L）以及甲醇加入比例（45%，50%，52%，55%，60%，V／V）对分离度、灵敏度以及保留时间的影响（图3－B、图3－C）.结果表明，当高氯酸铵浓度为0.010mol／L、甲醇加入比例为52%（V／V）时，效果最佳.

图3 流动相体系对灵敏度和保留时间的影响Fig.3 Influence of the mobile phase on sensitivity and retention time

3.2 柱温和流速的选择

实验考察了柱温（25，30，40，45，50℃）以及流速（0.40～1.20mL／min）对分离度、灵敏度以及保留时间的影响.柱温50℃、流速0.80mL／min为实验最佳选择.

3.3 改进方法与中国国家药品标准中检测方法与含量测定结果的比较分析

针对现行中国国家药品标准（WS1－XG－2002）收载的质量标准，不能实现对主成分异构体的同时分离，以及没有对有关物质的限度检查作出明确规定等问题，课题组参考国内外相关文献，优化了色谱条件，建立了同时分离检测甘草酸原料药以及各种剂型制剂中主成分异构体18α－Gly和18β－Gly和有关物质的方法.本方法分析时间短，结果准确可靠.与中国国家药品标准（WS1－XG－2002）收载的甘草酸类制剂质量标准比较，采用本实验建立的方法对甘草酸总含量进行测定，测定结果无显著性差异.本方法能够更全面反映原料药及制剂的质量情况，满足质量检测中对原料药及不同剂型制剂中各成分单独进行准确定量检测的要求.本方法的建立为中国国家药品标准中对甘草酸原料药及不同剂型制剂的增补与修订，以及在中国药典中增补相关内容提供了依据，可用于原料药及不同剂型制剂样品的分析测定.

［1] CLASSEN－HOUBEN D，SCHUSTER D，DA CUNHA T，et al.Selective inhibition of 11Beta－hydroxysteroid dehydrogenase 1by 18alpha－glycyrrhetinic acid but not 18beta－glycyrrhetinic acid［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2009，113（3－5）：248－252.

［2] LIN J C，CHEMG J M，HUNG M S，et al.Inhibitory effects of some derivatives of glycyrrhizic acid against Epstein－Barr virus infection：structure－activity relationships［J］.Antiviral Res，2008，79（1）：6－11.

［3] REN Weichao，LU Yang，JING Jing，et al.Determination of glycyrrhizin in dog plasma by liquid chromatography－mass spectrometry and its application in pharmacokinetic studies［J］.Eur J Mass Spectrom，2010，16：673－678.

［4] 王宇光，杨明会，马增春，等.18β－甘草酸和18α－甘草酸对大鼠原代肝细胞CYP3A酶表达的影响［J］.中国中药杂志，2009，34（3）：307－311.WANG Yuguang，YANG Minghui，MA Zengchun，et al.Effects of 18β－glycyrrhizic acid and 18α－glycyrrhizic acid on mRNA and protein expression of cytochrome P450 3Ain cultured rat primary hepatocyte［J］.Chia Journal of Chinese Materia Medica，2009，34（3）：307－311.

［5] ZOU Qiaogen，WEI Ping，LI Jing，et al.Simultaneous determination of 18α－and 18β－glycyrrhetic acid in human plasma by LC－ESI－MS and its application to pharmacokinetics［J］.Biomedical Chromatography，2009，23（1）：54－62.

［6] 赵鸿，鹿程华，玄春香.紫外分光光度法测定甘草酸单铵含量［J］.中国医院药学杂志，2006，26（12）：1577－1578.ZHAO Hong，LU Chenghua，XUAN Chunxiang.Detection content of monoammonium glycyrrhizinate by ultraviolet spectroscopy［J］.Chin J Hosp Pharm，2006，26（12）：1577－1578.

［7] 梁玉玲，管延英，阳丽，等.胀果甘草愈伤组织培养及甘草酸含量分析［J］.河北大学学报：自然科学版，2000，20（4）：365－368.LIANG Yuling，GUAN Yanying，YANG Li，et al.Cultivation of callus tissue of glycyrrhiza inflate and the glycyrrhizic acid content analysis［J］.Journal of Hebei University：Natural Science Edition，2000，20（4）：365－368

［8] 沈阳，沈金灿，庄峙厦，等.HPCE法与HPLC法用于甘草中主要活性成分甘草酸及其降解产物甘草次酸分析的比较［J］.药物分析杂志，2006，26（4）：421－425.SHEN Yang，SHEN Jincan，ZHUANG Zhixia，et al.Comparison between HPCE and HPLC for the analysis of main active components in licorice［J］.Chin J Pharm Anal，2006，26（4）：421－425.

［9] SABBIONI C，MANDRIOLI R，FERRANTI A，et al.Separation and analysis of glycyrrhizin，18beta－glyeyrrhetic acid and 18alpha－glycyrrhetic acid in liquorice roots by means of capillary zone electrophoresis［J］.J Chromatogr A，2005，1081（1）：65－71.

［10] SAKAE AMAGAYA，ETSUKO SUGISHITA，YUKIO OGIHARA.Separation and quantitative analysis of 18α－glycyrrhetinic and 18β－glycyrrhetinic acid in glycyrrhizae Radix by gas－liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography，1985，320：430.

［11] 吕坚，吴锡铭，周晴.气相色谱法测定大鼠血浆中18－H甘草酸差向异构体含量［J］.中国药学杂志，1993，28（9）：552－554.LÜJian，WU Ximing，ZOU Qing.Detection content of 18－H Glicyrrhizic acid epimer in rat plasma by gas chromatography［J］.J Chin Pharm Sci，1993，28（9）：552－554.

［12] 阎正，肖进进，崔建波，等.顶空毛细管气相色谱法测定甘草酸二铵中乙醇残留量［J］.河北大学学报：自然科学版，2005，25（6）：619－622.YAN Zheng，XIAO Jinjin，CUI Jianbao，et al.Determination of Alcohol Residue in Diammonium Glycyrrhizinate by Open－tubular Column Gas Chromatography［J］.Journal of Hebei University：Natural Science Edition，2005，25（6）：619－622.

［13] 宋红波，刘茜，赵辉，等.甘草酸铵类制剂中甘草酸差向异构体的分析［J］.药物分析杂志，2012，32（5）：883－886.SONG Hongbo，LIU Qian，ZHAO Hui，et al.Analysis of 2epimers in ammonium glycyrrhizinate drugs［J］.Chin J Pharm Anal，2012，32（5）：883－886.

［14] ZOU Qiaogen，ZHAN Ying，WEI Ping，et al.Isolation and characterization of related impurities of monoammonium glycyrrhizinate and development of RP－HPLC method for quality control study［J］.Journal of Liquid Chromatography＆Related Technologies，2009 32：1953－1968.

［15] 曹站霞，王纪力，唐进法.HPLC测定复方甘草酸苷氯化钠注射液中甘草酸铵含量［J］.中成药，2009，31（6）：982－983.CAO Zhanxia，WANG Jili，TANG Jinfa.Determination of glycyrrhizic acid in Compound glycyrrhizin Sodium Chloride Injection by HPLC［J］.Chinese Traditional PatentMedicine，2009，31（6）：982－983.

［16] SHEN Shufeng，CHANG Zhidong，LIU Ji，et al.Simultaneous determination of glycyrrhizic acid and liquiritin in glycyrrhiza uralensis extract by HPLC with ELSD detection［J］.Journal of Liquid Chromatography ＆Related Technologies，2006，29：2387－2397.

［17] 颜苗，张金娇，李焕德，等.RP－HPLC法同时测定甘草酸制剂中18α－、18β－甘草酸的含量［J］.药物分析杂志，2012，32（2）：301－309.YAN Miao，ZHANG Jinjiao，LI Huande，et al.RP－HPLC simultaneous determination of 18α－、18β－glycyrrhizic acid in glycyrrhizin preparations［J］.Chin J Pharm Anal，2012，32（2）：301－309.