小窝蛋白1介导TGF—β信号通道调控肺细胞外基质重塑机制研究

周游+孙伏喜+周蓉+等

【摘要】 目的：探讨caveolin-1通过介导TGF-β信号通道在体外调控小鼠肺细胞外基质重塑的机制研究。方法：选取cav1-/-小鼠作为动物模型设为实验组，野生型C57BL/6J小鼠设为对照组，检测肺机械性指标，测定Ⅰ型胶原纤维与弹性纤维含量及mRNA水平，检测肺血管蛋白渗出及支气管灌洗液（BAL）中细胞含量及细胞因子水平，测定TGF-β下游信号分子Smad2及ERK1/2水平。结果：与对照组比较，实验组中肺顺应性下降，僵硬度增加（P<0.05）；BAL中总蛋白及白蛋白水平和静脉注射伊文思蓝在肺组织的含量均明显增加（P<0.05）；Ⅰ型胶原纤维与弹性纤维含量及mRNA水平增加（P<0.05）；Smad2及ERK1/2水平均明显提高（P<0.05）；但BAL中细胞含量及细胞因子水平无差异。结论：小窝蛋白1通过介导TGF-β信号转导在体外上调细胞外基质重塑，促进肺纤维化发生。

【关键词】 小窝蛋白1； TGF-β； 细胞外基质； 信号传导； 肺纤维化

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是ICU常见的且死亡率高的一种急症状态，近年来随着机械通气、表面活性物质替代疗法等新技术应用，其存活率已显著提高。然而，长时间吸入高浓度氧，幸存者易发生肺部氧化应激损伤。目前，高氧肺损伤及肺纤维化已成为ICU最为棘手的问题之一和慢性肺疾病的最常见形式，但目前高氧肺损伤及肺纤维化的确切机制尚未完全阐明。已知细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的重塑参与了高氧肺损伤的整个病理过程，若ECM重塑正常，则损伤完全修复，肺结构正常；若ECM重塑紊乱，将导致肺纤维化。因此，ECM重建是关系高氧肺损伤结局的关键因素。

目前已知在Ⅰ型肺泡上皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞等细胞质膜上存在约50～100 nm大小的囊性凹陷结构——小窝（caveolae），而小窝蛋白（caveolin，cav）1是小窝胞浆面包被的一种21～24 kD的膜蛋白，是许多信号分子如TGF-β活性状态的重要调节者。TGF-β是一种多效生长因子，可以调控细胞生长、分化、程序性死亡及ECM产生。研究发现，cav1可以通过调节TGF-β受体表达从而调控TGF-β信号转导[1-2]。在变异原诱发的急性肺损伤小鼠模型中，cav1对肺间质纤维化、肺泡支气管化及气道重塑有重要作用，并且发现TGF-β信号增强，胶原分泌增加[3-5]。有研究报道，cav1基因敲除小鼠出现肺泡腔狭窄、肺泡壁增厚及细胞过多现象[6]。故推测cav1可以通过介导TGF-β信号转导以此调控ALI/ARDS时的ECM重塑水平。本研究应用cav1-/-小鼠模型探讨Cav1对ECM重塑作用及其具体信号机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型、主要试剂及分组 本实验分为两组：（1）实验组：实验动物为1周龄C57BL/6J cav1-/-小鼠，购自美国Jackson实验室；（2）对照组：实验动物为1周龄野生型C57BL/6J小鼠，购自南京医科大学实验动物中心。每组均为15只小鼠。主要试剂：Sircol胶原测定盒购自北京友谊中联生物科技有限公司。RNeasy RNA试剂盒购自美国QIAGEN试剂公司。细胞裂解液购自美国Sigma试剂公司（含1 mM DTT、1×蛋白酶抑制剂混合物、5 mM EDTA）。

1.2 肺机械性测量 动态顺应性及弹性回缩力参数通过强迫振荡法flexiVent呼吸功能研究系统获得。小鼠按体重予以氯胺酮（100 mg/kg）及甲苯噻嗪（10 mg/kg）静脉麻醉后插气管套管后连接flexiVent仪器通畅，参数设定如下：PEEP设定为2 cm H2O，呼吸频率为150次/min，潮气量为7.5 mL/kg。气道阻力、顺应性及弹性回缩力测定15次，应用单室腔模式进行数据分析。数据测定后处死小鼠，支气管肺泡灌洗后取肺组织标本，以进行RNA及蛋白提取。

1.3 组织学检查及胶原沉着测定 肺组织标本固定于4%多聚甲醛，包埋切片后予以天狼星红染色，在光镜下观察组织标本，利用ImagePro图像分析仪测定肺实质及气道周围的胶原含量。

取肺组织冰冻后应用Sircol胶原测定试剂盒测定胶原沉着水平。50 mg肺组织均匀搅碎于500 μL的提取液并4 ℃搅拌过夜，组织匀浆在4 ℃高速离心（15 000 g）1 h，按照试剂盒说明操作，用分光光度仪在540 nm波长测定光密度，对比标准胶原含量曲线图得出胶原含量。

1.4 肺血管渗出测定 对小鼠行支气管灌洗术后取灌洗液，在20 ℃时1000 g低速离心10 min后取上清液储存于-80 ℃环境，测定肺组织渗出总蛋白及白蛋白含量。总蛋白含量采用Bradford法测定，白蛋白测定应用小鼠白蛋白ELISA试剂盒方法测定。

应用伊文思蓝注射后计算伊文思蓝含量来评价肺血管通透性。取3月龄小鼠麻醉后按20 mg/kg剂量尾静脉注射伊文思蓝，注射1 h后处死小鼠，开胸后左心室灌注5 mL PBS。取出肺组织，搅碎成组织匀浆固定于10%甲酰胺60 ℃孵育12～18 h，5000 g离心30 min后收集上清液，测定620 nm和720 nm吸收率。伊文思蓝含量（每克肺组织中伊文思蓝毫克含量）按下列公式计算：A620 -（1.426×A720+0.030），结果对比伊文思蓝标准曲线得出伊文思蓝含量。

1.5 支气管灌洗液（BAL）中细胞含量及细胞因子水平 两组BAL在20 ℃ 1000 g离心10 min后收集细胞沉积，在100 μL的PBS中打匀，使用标准血细胞计数板来计算总细胞数。分别应用小鼠Th1/Th2细胞因子ELISA试剂盒测定BAL中细胞因子IL-2、TNF-α及IFN-γ。endprint

1.6 弹性纤维沉着测定 利用免疫组化方法检测弹性纤维，切片用5%山羊血清封闭1 h，用弹力蛋白一抗4 ℃孵育过夜，在PBS及0.05% Tween-20清洗3次，再与Alexa Fluor 568标记的二抗孵育过夜，细胞核用DAPI复染。切片包被后在荧光显微镜下观测。

1.7 RNA及蛋白表达分析 应用RNeasy RNA试剂盒从肺组织标本中提取RNA，按试剂盒说明操作。RNA标本在20 ℃与0.05 U/mL DNase Ⅰ孵育15 min，应用定量RT-PCR法测定Ⅰ型胶原α2链（col1α2）及弹性蛋白原（eln）mRNA水平。

肺冰冻标本用冰PBS液冲洗3次后，组织匀浆加入0.5 mL细胞裂解液直接煮沸5 min，冰上冷却后，12 000 rpm离心15 min，取上清液，按照Western blot试剂盒的说明操作，分别加入小鼠anti-Smad2抗体及小鼠anti-ERK1/2抗体后，4 ℃摇摆过夜。漂洗3次后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG多克隆抗体避光室温孵育2 h，按照发光试剂盒的说明操作，X线曝光后应用NIH Image凝胶图像处理系统分析净光密度值。

1.8 统计学处理 采用SPSS 11.5软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较用t 检验或ANOVA分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肺机械性变化测定结果的比较 实验显示，实验组小鼠的肺顺应性较对照组明显降低，与此相反实验组小鼠的肺弹性回缩力及气道阻力较对照组均明显增加（P<0.05）。结果表明，实验组小鼠肺的僵硬度明显增加。

2.2 肺组织胶原纤维沉着检测 实验组小鼠的气道周围及肺实质胶原纤维沉着较对照组均明显增加（P<0.05），见图1。并且在应用Sircol法对组织匀浆测定胶原纤维含量结果显示，实验组的胶原纤维含量为（41.2±5.4）μg/mg，而对照组小鼠为（27.7±3.1）μg/mg，表明实验组较对照组明显增加（P<0.05）。说明实验组小鼠肺的胶原纤维沉着明显增加，也是肺僵硬度增加的病因之一。

2.3 肺血管蛋白渗出及伊文思蓝含量测定 肺血管渗出过多也是肺僵硬度增加的病因之一，故检测BAL中蛋白渗出水平及肺实质伊文思蓝积聚可以反映肺血管渗出状况。实验组小鼠BAL中总蛋白及白蛋白水平较对照组均明显增加（P<0.05），且静脉注射伊文思蓝在肺组织含量也较对照组明显增加（P<0.05），见图2。

2.4 两组BAL中细胞含量及细胞因子水平测定结果的比较 在对BAL中细胞含量检测显示两组无明显差异（P>0.05），并且两组中细胞因子如IL-2、TNF-α及IFN-γ也无明显差异（P>0.05）。结果表明，cav1-/-小鼠与野生型小鼠肺组织无明显炎症差别。

2.5 col1α2及eln的mRNA水平与弹性纤维沉着测定 实验组小鼠肺组织中I型胶原α2链（col1α2）及弹性蛋白原（eln）mRNA水平均明显高于对照组标本水平（P<0.05）。荧光显微镜下观测显示，实验组的肺实质及肺泡壁的弹性纤维分布较对照组均明显增加。结果表明实验组小鼠的肺组织弹性纤维沉着明显增加。

2.6 TGF-β信号转导系统表达水平测定 已知cav1-/-小鼠缺乏cav1会上调TGF-β信号转导，而TGF-β是ECM基因转录活性主要的调节因子。TGF-β下游的信号通路主要为Smad2和ERK1/2，故本研究应用Western blot法检测肺组织中Smad2和ERK1/2水平。结果显示，实验组中Smad2和ERK1/2水平较对照组均明显升高（P<0.05）。结果说明TGF-β信号转导系统Smad2和ERK1/2在cav1-/-小鼠上调。

3 讨论

长期以来，有关小窝蛋白1（cav1）的研究主要集中在胆固醇代谢、肿瘤转移、膜物质转运、信号转导等方面，而在急性肺损伤（acutelung injury，ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）所致肺纤维发病机制的研究较为少见。研究发现，cav1广泛存在于肺泡Ⅰ型上皮细胞膜，对于形成囊性凹陷结构——小窝（caveolae）至关重要，而小窝内含有多种信号受体，其中TGF-β信号通路对于ECM沉着、肺内皮细胞分化及相关病理状态至关重要[3]。为了解cav1对肺的生理功能及结构影响，本研究探讨了肺功能、TGF-β信号通路及ECM重塑间关系。已有研究显示，cav1缺乏或降低可以上调TGF-β水平，而体外培养肺成纤维细胞时予以外源性TGF-β则可以上调数个ECM基因转录[3，7-8，10]。cav1-/-小鼠的肺功能出现有害改变，因而了解TGF-β信号系统改变是否也会造成ECM重塑成了需要解决的问题。Ⅰ型胶原纤维和弹性纤维是ECM重要成员，也是决定肺顺应性重要因素[11]，因而本研究选取I型胶原纤维和弹性纤维作为研究ECM重塑对象。研究中发现，cav1-/-小鼠相比与野生型小鼠，其肺顺应性下降，而肺弹性回缩力及气道阻力增加，表明肺的僵硬度增加，这与肺的ECM增加及肺血管渗出增加相关[12-13]。实验中分别对肺组织的Ⅰ型胶原纤维和弹性纤维含量检测，显示cav1-/-小鼠产生ECM是明显升高，这一点不论从组织切片还是转录水平都得到了证实。

同时研究中显示，cav1-/-小鼠的支气管灌洗液蛋白渗出也明显增加，并且在应用伊文思蓝静脉注射后渗透至肺组织含量明显增加也证实cav1-/-小鼠的肺血管通透性增加。在毛细血管内皮细胞中，30%细胞表面存在小窝，因而cav1缺陷会增加肺血管通透性，促进渗出[14]。已知在正常人的血管内皮细胞内TGF-β可以上调NO合成酶的活性，而NO合成酶产生的NO会增加血管通透性，故TGF-β被认为是直接导致肺水肿的关键调节物[15-16]。而cav1可以下调TGF-β信号水平，因而可以推测cav1-/-小鼠肺组织中血管渗出增加是因TGF-β过度激活而致使NO合酶活性过强所致。endprint

本研究从以上两方面证实cav1可以调控肺组织ECM重塑水平，进而影响肺的顺应性变化。已知cav1可以调节TGF-β表达水平，但为进一步了解cav1是否通过TGF-β信号系统来调控ECM重塑，研究选取了TGF-β的两个重要下游信号因子Smad2和ERK1/2作为研究对象。有研究表明，各种的TGF-β下游信号途径如Smads、ERK1/2及p38 MAPK等对调控弹性纤维mRNA及转录后稳定有重要作用，比如Smad3缺乏则会导致肺弹性纤维表达抑制进而出现肺气肿[17-18]。研究结果显示，cav1-/-小鼠的Smad2和ERK1/2表达明显增加，证实cav1介导TGF-β信号系统调控肺ECM重塑。

cav1-/-小鼠具有ALI/ARDS相似的病理特点，如肺胶原积聚、血管通透性增加及肺顺应性下降等，因而充分了解cav1功能具有很好的临床相关性，也为治疗ALI/ARDS提供一个潜在的新型治疗靶向。

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（收稿日期：2014-02-12） （本文编辑：欧丽）endprint

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