BRAF T1799A基因突变甲状腺乳头状癌超声特征

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(青岛大学医学院附属医院内分泌科，山东 青岛 266003)

BRAF T1799A基因突变甲状腺乳头状癌超声特征

丛小飞，赵世华，王颜刚，王萍，刘鑫

(青岛大学医学院附属医院内分泌科，山东 青岛 266003)

目的研究甲状腺乳头状癌(PTC)组织中BRAF T1799A突变与结节超声特征之间的关系。方法选择行甲状腺切除的PTC病人160例，应用聚合酶链反应及DNA直接测序法检测新鲜组织标本中BRAF T1799A基因突变情况，结合甲状腺超声检查结果分析BRAF T1799A基因突变与结节边界、钙化、血流、淋巴结转移及结节大小等超声特征的关系。结果160例PTC病人中，BRAF T1799A突变阳性者46例，突变率为28.75%。BRAF T1799A突变阳性病人血流丰富的比例大于阴性者(χ2=4.88，P<0.05)；Logistic回归分析显示，血流丰富与BRAF T1799A突变呈正相关(OR=3.368，P<0.01)；BRAF T1799A突变阳性组与阴性组其他超声特征比较差异无显著性(P>0.05)。结论PTC组织中BRAF T1799A基因突变与结节血流关系密切，而与其他超声特征无明显相关性。

甲状腺肿瘤；BRAF；突变；超声检查

近几年来，甲状腺乳头状癌(PTC)组织中的BRAF T1799A突变受到广泛关注，现已明确该突变通过持续激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，促进肿瘤的发生和发展[1]，且与PTC甲状腺包膜外浸润、淋巴结转移及肿瘤TNM分期等特征密切相关，通过多种分子机制影响甲状腺肿瘤的生长方式。作为一种新的分子标志物，BRAF T1799A突变在PTC的辅助诊断、预后评估、指导治疗等方面起着重要作用[2]。研究结果已表明，PTC中BRAF T1799A突变与血管内皮生长因子(VEGF)过量表达密切相关，且在PTC中发现了不同频率的表皮生长因子受体(EGFR)的突变[3]，而VEGF与EGFR的过量表达通过多种途径共同参与肿瘤血管的生成过程, 在肿瘤生长、进展与转移中发挥重要作用[4]。以上机制很有可能通过BRAF T1799A突变而引起PTC结节生长方式的改变，因此，本研究旨在探讨BRAF T1799A突变与PTC结节超声特征的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象

选择2011—2013年于我院行甲状腺切除术的PTC病人160例，其中男38例，女122例；平均年龄为(45.73±13.83)岁。病人均经组织病理学检查确诊。标本采集和病例收集经过病人知情同意。癌结节按大小分为3级，<1 cm为微小癌，1～3 cm为中等大小癌，>3 cm为大结节癌；结节边界分为清晰和欠清晰；回声分为高、低及混合回声；钙化情况分为有和无钙化；血流根据结节内部及周边的分布情况分为丰富(3个以上点状血流、条状血流信号、高阻动脉血流信号)和不丰富(血流分布未见异常、1～2个点状血流)；淋巴结转移及腺体外浸润分为有和无转移或浸润。

1.2方法

1.2.1DNA提取和PCR扩增 收集术后新鲜甲状腺癌组织标本50 mg，按照组织基因组DNA提取试剂盒说明书中的步骤提取各样本中的基因组DNA，取基因组DNA 2 μL,用紫外线分光光度计检测样本吸光度(A)值，以测定所提取DNA的浓度和纯度，所得合格DNA放于-20 ℃冰箱中保存备用。采用普通PCR方法对BRAF基因第15外显子进行扩增。目的基因片段为：ATATATTTCTTCAT-GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTT-GGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGT-GGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGA-TCCATTTTGTGGATG，其上游引物序列：5′-GCT-TGCTCTGATAGGAAAATGAG-3′，下游引物序列：5′-GTAACTCAGCAGCATCTCAGG-3′。

1.2.2产物测序 PTC的PCR反应产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行基因测序，分析各样本中有无BRAF T1799A突变。

1.2.3B超资料的分析 对160例病人的B超资料,包括癌结节边界、回声、钙化、血流及结节数量、淋巴结大小、结节大小及腺体外浸润情况等超声表现进行分析。

1.2.4统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，组间超声特征差异比较采用卡方检验, BRAF T1799A与超声表现的相关性采用Logistic回归分析。

2 结 果

本文160例PTC标本中BRAF T1799A突变阳性者46例，阴性者114例，阳性率为28.75%(图1、2)。BRAF T1799A突变阳性与阴性组年龄分别为(47.85±12.94)、(44.88±14.15)岁，BRAF T1799A突变阳性组男女分别为9、41例，BRAF T1799A突变阴性男女分别为29、81例，两组年龄、性别相比较差异无统计学意义(P>0.05)。BRAF T1799A突变阳性组血流丰富的比例明显高于阴性组(χ2=4.88，P<0.05)。见表1。Logistic回归分析显示，血流丰富与BRAF T1799A突变间呈正相关(OR=3.368，P<0.01)，与结节的边界、回声、钙化、淋巴结转移及腺体外浸润等超声特征均无相关性(P>0.05)。见表2。

图1 BRAF第15外显子1799位点基因分析图谱

图2 BRAF第15外显子1799位点T-A基因突变分析图谱

组别边界清晰模糊回声高低混合钙化有无血流丰富否多结节是否淋巴结转移有无腺体外浸润有无结节大小小中大阳性133714723713272325252129113916286阴性3971710218525397156543476308034733

3 讨 论

PTC是甲状腺癌中最常见的一种类型，而BRAF T1799A突变主要发生于PTC，国内外报道的突变率为28%～83%[5-6]，本研究的突变率为28.75%，处在较低水平。BRAF基因是RET和RAS的下游蛋白激酶，是Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路关键成分，其突变可持续激活MAPK信号通路，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，形成肿瘤[7]。很多研究证实，BRAF T1799A突变与高侵袭性的临床及病理特征密切相关，如淋巴结转移、腺体外浸润、肿瘤分期等。XING等[8]研究认为,检测细针穿刺样本的BRAF T1799A突变情况可有助于甲状腺癌的诊断，经细胞学诊断为PTC的病人应在手术前检测其穿刺样本的BRAF T1799A突变情况,以指导手术方式。由此可见，BRAF T1799A突变在PTC中具有独特而重要的地位。

随着超声显像成为甲状腺肿瘤的主要诊断手段，二者的关系也受到关注。已有文献报道，存在BRAF T1799A突变的PTC倾向于结节前后径大于横径，钙化的发生率也相对较高，但数据均无统计学差异[9]，国内外对BRAF T1799A突变与结节大小关系的结论尚不一致[10-11]。本研究结果显示，BRAF T1799A突变与结节大小无相关性，与国内

表2 BRAF突变阳性与阴性组多因素Logistic回归分析

报道结果一致。本研究结果显示，BRAF T1799A突变阳性与阴性组在结节边界、回声、钙化、结节大小、腺体外浸润、淋巴结转移等超声表现方面比较差异均无显著性，提示PTC中BRAF T1799A突变阳性超声表现尚无特异性。而Logistic多元逐步回归分析显示， BRAF T1799A突变与血流丰富相关，其机制尚不明确。有研究结果显示，BRAF突变与VEGF的过量表达密切相关[12]，而VEGFR信号转导通路参与肿瘤周围血管新生内皮细胞的迁移、增殖、生存等过程，在肿瘤周围血管生成中发挥重要的作用。XING等[13]研究显示，EGFR在PTC中的突变率为5%，其突变与STAT、MAPK、PI3K/AKT活性增强密切相关。PTC组织中BRAF突变率高，EGFR突变与BRAF突变很可能具一定相关性。EGFR高表达可促进血管生成和肿瘤细胞的增殖、黏附、侵袭和转移, 抑制肿瘤细胞的凋亡[14]。因此认为，BRAF T1799A突变可能通过以上两种机制引起结节周围新生血管形成，使结节周围血流信号增加，并增强了肿瘤的侵袭性。但是，具体机制还需深入探索。此外，由于没有进行大样本量的试验，且本研究中甲状腺超声检查对结节血流结果的报告较粗略，没有进行分级，无具体血流阻力值，所以具有一定的局限性，未来还需要做更加细致的研究。本研究没有发现其他超声特征与BRAF T1799A突变有相关性，而很多研究证实BRAF T1799A突变与淋巴结转移及病理分期呈正相关，分析其原因可能为超声对淋巴结转移的检查不敏感，应结合病理报告中淋巴结转移的结果进行分析。

综上所述，认为PTC中BRAF T1799A突变与结节血流具有相关性，可能会对甲状腺结节穿刺活检起到提示作用，并通过检测穿刺标本的BRAF T1799A突变情况，指导手术方式，评估预后。但超声尚不能准确提示BRAF T1799A突变的存在，两者应有效结合，以更好地指导PTC的诊断和治疗。

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(本文编辑 厉建强)

ULTRASOUNDFEATURESOFBRAFT1799AGENEMUTATIONPAPILLARYTHYROIDCARCINOMA

CONGXiaofei,ZHAOShihua,WANGYan′gang,WANGPing,LIUXin

(Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the correlation between BRAF T1799A gene mutation in tissue of papillary thyroid carcinoma (PTC) and the ultrasound features of the thyroid.MethodsOne hundred and sixty patients with PTC underwent thyroidectomy were enrolled in this study. Using polymerase chain reaction (PCR) and direct DNA sequencing, the BRAF T1799A gene mutation in fresh tissue samples was detected, which was analyzed by comparing with ultrasonographic results in terms of the boundary of nodules, calcification, blood supply, lymph node metastases and tumor size.ResultsOf the 160 patients,46 were BRAF T1799A positive, mutation rate being 28.75%. Those of positive BRAF T1799A showed a higher ratio of rich blood supply of their tumor samples than the negative ones (χ2=4.88,P<0.05). Logistic regression showed a positive correlation between BRAF T1799A mutation and rich blood flow (OR=3.368,P<0.01). The chi-square test showed no significant differences between BRAF T1799A mutation positive and negative groups in other sonographic features (P>0.05).ConclusionBRAF T1799A mutation in PTC is closely associated with the blood flow around the nodules but not with other sonographic features.

thyroid neoplasms; BRAF; mutation; ultrasonography

2013-08-31;

2014-03-01

山东省医药卫生科技发展计划项目(2013WS0266)

丛小飞(1986-)，女，在读硕士研究生。

赵世华(1962-)， 男，主任医师，硕士生导师。

R736.1

A

1008-0341(2014)03-0210-03