黄连解毒汤对丙戊酸钠在氯化锂－匹罗卡品致癫痫大鼠体内的减毒增效作用＊

周海云，李品军，王 强，黄明春，刘 耀

（1.重庆市石柱县人民医院内三科 409100；2.第三军医大学第一附属医院药剂科，重庆400038）

丙戊酸钠（sodium valproate，SVA）为临床一线广谱抗癫痫药物，其作用机制与抑制γ－氨基丁酸转氨酶活性，增强谷氨酸脱羧酶活性，升高脑内γ－氨基丁酸有关［1－2］。但长期服用SVA可导致共济失调、学习记忆能力下降、肝功能受损等［3］。黄连解毒汤（HLT）可泻火解毒，临床上常用于各种热症、阿尔茨海默病等［4］。临床研究发现HLT同SVA等抗癫痫药物合用，对缓解癫痫发作时的阵挛及焦躁精神状态有一定效果。本研究对SVA联合HLT对SVA的解毒增效作用及其机制进行初步研究，为SVA的临床使用提供参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选取SPF级Wistar大鼠，全为雄性，5周龄，体质量（210.2±9.2）g，由重庆市中药研究院实验动物研究中心提供，动物合格证号SCXK（渝）2009－0001。

1.2 仪器与试剂 CM3050S型冰冻切片机（德国Leica公司）；Viva－E血药浓度分析仪（德国Siemens公司）。谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH－Px）、丙二醛（MDA）检测试剂盒购自江苏南京建成生物工程公司，批号分别为20120616，20111218，20120908和20121015；Emit 2000SVA定量检测试剂盒购自德国Siemens公司，批号20120612；匹罗卡品注射液（2mg／mL），购自天津金耀氨基酸有限公司，批号20120310；氯化锂（含量大于98%）购自大连美罗生物科技有限公司，批号20120608；氢溴酸东莨菪碱注射液（0.3mg／mL）购自成都第一制药有限公司，批号20100816；SVA购自江苏恒瑞医药股份有限公司，批号20120915。HLT制备：取黄连、栀子、黄柏和黄芩4种中药饮片均购自太极集团重庆中药饮片有限公司，按1.5∶1.5∶1.0∶1.0加水煎煮3次，每次30min，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至1.5g／mL（按生药计）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组、造模与给药 实验动物造模参照文献［5－6］。造模成功后将癫痫模型大鼠分为5组（n＝10）：模型组、SVA组、SVA联合HLT低剂量治疗组、SVA联合HLT中剂量治疗组和SVA联合HLT高剂量治疗组。另选取10只健康大鼠为正常对照组。4个治疗组药物均用1mL 0.9%氯化钠溶液溶解稀释后灌胃给药。其中，SVA组按100 mg·g－1·d－1给予SVA，低、中、高3个SVA联合 HLT给药大鼠则分别同时灌胃给予100mg·g－1·d－1剂量SVA及25、50和100mg·g－1·d－1HLT。对照组和模型组灌胃给予1 mL 0.9%氯化钠溶液，连续给药4周。末次给药后观察15 min内大鼠出现癫痫反应次数。

1.3.2 血液及肝脏标本采集、匀浆 大鼠在观测行为学指标后继续给药48h后，腹腔注射10%水合氯醛（3.5mL／kg）麻醉，下腔静脉取血后，处死，摘取肝脏标本，取右叶以0.9%冰冷氯化钠溶液冲洗后，部分干冰速冻保存。其余部分洗净后匀浆，匀浆液用2倍量0.9%冰冷氯化钠溶液和丙酮反复洗涤至上清无血色后，用3 000r／min离心15min沉淀，备用。

1.3.3 血清ALT、AST活性和SVA血药浓度测定 ALT、AST活性测定参照试剂盒使用说明进行，均采用赖氏比色法。SVA血药浓度测定按定量试剂盒说明书进行。

1.3.4 GSH－Px活性和 MDA水平检测 GSH－Px活性和MDA水平均参照试剂盒使用测定。GSH－Px活性测定采用而巯基比色法，MDA测定用硫代巴比妥酸比色法。

1.3.5 肝组织病理学检查 剪取大鼠肝右叶相同部位，冷冻切片机切片，10%中性甲醛液固定，石蜡包埋、切片（厚4μm），苏木素－伊红（HE）染色。在每张切片上选取10个视野进行观察。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料以表示，采用单因素方差分析方法，组间比较采用Tuckey法。单向有序计数资料采用 Wilcoxoh秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 合用SVA和HLT对癫痫大鼠行为学的影响 对照组大鼠没有出现癫痫行为，模型组大鼠全部出现癫痫行为症状，按Racine分级判定，均为Ⅱ级以上表现，且各组半数（n＝5）表现Ⅲ级发作症状。SVA治疗后，大部分实验大鼠仍有痫样行为，但Racine分级表现有所降低，Ⅲ级以上表现仅4只大鼠，没有大鼠发生Ⅴ级表现，但统计学分析差异无统计学意义（P＞0.05）。同时服用SVA和不同剂量HLT处理的大鼠，其癫痫表现行为较模型组和SVA组进一步改善，SVA联合HLT高、中剂量治疗，均未观察到大鼠Ⅲ级及Ⅲ级以上癫痫发作症状，但与模型组及SVA组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 合用SVA和HLT对癫痫大鼠行为学的影响（n）

2.2 SVA联合HLT对癫痫大鼠ALT、AST、GSH－Px活性和MDA水平的影响 对照组大鼠与模型组大鼠的血清ALT、AST、GSH－Px活性和 MDA水平差异无统计学意义（P＞0.05）。在给予SVA 100mg·g－1·d－14周后，大鼠血清中ALT、AST活性和肝组织MDA水平显著增加（P＜0.01），而肝GSH－Px活性明显下降（P＜0.05）。同时给予SVA和HLT，ALT、AST较单独给予SVA下降，且下降程度SVA联合高剂量HLT组＞SVA联合中剂量HLT组＞SVA联合低剂量HLT组。而SVA联合高剂量HLT组（100mg·g－1·d－1）给药较SVA组，对 GSH－Px活性下降显著减少（P＜0.05）。但SVA和不同剂量HLT联合使用，对肝组织 MDA水平没有明显影响。

表2 合用SVA和HLT对癫痫大鼠ALT、AST、GSH－Px和MDA的影响±s，n＝10）

表2 合用SVA和HLT对癫痫大鼠ALT、AST、GSH－Px和MDA的影响±s，n＝10）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，与模型组比较；c：P＜0.05、d：P＜0.01，与SVA组比较。

组别 ALT（U·mL－1） AST（U·mL－1） GSH－Px（U·mg－1·prot－1） MDA（mol·g－1·prot－1）对照组 17.15±3.18 25.33±2.09 64.05±14.06 6.75±3.77模型组 17.74±2.25 24.54±8.53 61.59±4.80 6.52±0.95 SVA组 45.08±9.11b 85.00±7.50b 46.31±6.43a 10.75±2.18a SVA联合低剂量HLT组 39.86±4.19b 91.35±12.55b 48.29±7.39a 11.57±0.68a SVA联合中剂量HLT组 36.22±1.84bc 67.36±10.09bc 54.20±8.28 10.98±4.35a SVA联合高剂量HLT组 25.72±0.86bd 47.79±7.19ad 52.15±10.20c 10.06±1.33a

图1 SVA联合HLT对癫痫大鼠SVA血药浓度的影响（n＝10）

2.3 SVA联合HLT对SVA血药浓度的影响 SVA血药浓度测定结果见图1。多次给药后SVA组大鼠血药浓度在178.560～209.367μg·mL－1。合用 HLT后，癫痫大鼠体内SVA血药浓度下降，其中SVA联合中剂量和SVA联合高剂量组SVA血药浓度下降明显（P＜0.01），两组血药浓度最低分别仅132.54μg·mL－1和85.396μg·mL－1。

2.4 肝组织病理学观察 对照组和模型组肝病理组织学检查未见异常。SVA组50%以上肝细胞水肿，核固缩，可见点状坏死和小灶性坏死，并伴有炎症浸润，可见肝中央静脉扩张（图2C）。SVA联合HLT治疗后，肝细胞状况明显改善散布。SVA联合中剂量HLT组肝细胞肿胀变性明显少于SVA组，但汇管区仍可观察到少量炎症细胞浸润，偶见嗜酸小体形成，未发现小灶性坏死点。而SVA联合高剂量HLT组（图2F）肝细胞排列整齐，形态大小较一致，未见肝细胞坏死，但仍可见极 少量炎症细胞浸润。

图2 SVA联合HLT对癫痫大鼠肝脏组织病理改变的影响（HE×400）

3 讨 论

HLT能改善阿尔茨海默病引起的学习记忆能力下降［7］、癫痫性精神病的情绪症状等［8］。目前对用于癫痫的研究报道较少。本实验采用匹罗卡品－氯化锂致癫痫大鼠模型，对SVA单用及合用不同剂量HLT后SVA药效及肝毒性进行研究。结果发现，同时服用SVA和HLT使癫痫模型大鼠的SVA血药浓度明显下降，说明HLT能影响SVA的体内代谢过程，但其机制不清楚。目前研究认为SVA在体内主要经肝细胞色素P450酶系代谢，主要是 CYP2s［9］。王晋朝等［9］和李丹等［10］研究发现HLT及其组分黄芩苷、小檗碱等能影响CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9的表达和活性［4］。因此合用 HLT致SVA血药浓度下降可能与其影响CYP酶有关。

合用HLT导致SVA血药浓度下降，但其抗痫作用并未减弱。有研究发现HLT可促进尼莫地平在大鼠脑组织中分布增加［11］，该作用与其促进大鼠脑微血管内皮细胞对尼莫地平的摄取、改善尼莫地平在血脑屏障上的转运有关［12］。因此，HLT这种降低SVA血药浓度同时未降低其治疗效果的机制可能与HLT改善SVA在血脑屏障上的转运有关。此外，另有研究发现HLT可改善痴呆小鼠和大鼠的学习记忆能力，改善脑部缺血状况［7－8］，影响炎症通路如NF－κB通路等［13－14］，因此，HLT同SVA的协同作用也可能与HLT自身的药理机制有关。

合用HLT能不同程度逆转SVA治疗癫痫大鼠导致的ALT、AST上升和GSH－Px活性下降，表明合用HLT对SVA导致的肝损伤具有拮抗作用。ALT，AST均属非特异性细胞内功能酶，正常时血清内含量很低；当肝细胞受损，肝细胞膜通透性增加时，其活性迅速增强。GSH－Px活性下降，也与组织细胞氧化损伤有关。因此，HLT对SVA致肝损伤的拮抗作用可能与其细胞保护作用有关。

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