CRISPR/Cas基因组靶向编辑技术综述

贾良杰

陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710119

CRISPR/Cas基因组靶向编辑技术综述

贾良杰

陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710119

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）是细菌特有的一种获得性免疫系统，研究人员将其改造成为靶向基因组编辑的工具，由于操作简单、成功率高且效率高，成为了靶向基因组编辑工具中的佼佼者。同时CRISPR/Cas系统也被改造作为一种极为有效的位点特异性的转录抑制/激活的工具而在研究工作中广泛应用，不仅如此，具有靶向细胞转录过程中产生的RNA底物的利用前景，从而起到与RNAi技术相类似的效果。CRISPR-Cas技术已经在基因功能研究、动物模型建立、基因治疗等领域得到广泛的推广和应用，有力地推动了相关领域的研究进展。

基因靶向修饰技术；Cas9；CRISPR/Cas；基因组编辑；基因治疗

CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated）系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质免疫系统，通过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，这些外源性遗传物质包括噬菌体或者外源性质粒[1]。CRISPR/Cas系统可分为三种类型，其中类型ⅡCRISPR/Cas系统由于其组成简单，被改造成为基因组靶向编辑的工具。在类型ⅡCRISPR/Cas系统中，CRISPR能够转录产生前体crRNA（Pre-CRISPR RNA，Pre-crRNA），Pre-crRNA经过Cas9-tracrRNA复合物加工后产生成熟的crRNA（CRISPR RNA），crRNA的5′端区域能够与靶位点互补配对，而其3′端能够与tracrRNA（trans-activating crRNA）及Cas9蛋白形成复合物，从而引导Cas9蛋白结合于靶位点进行特异性地切割。CRISPR/ Cas系统与其他外源核酸防御系统（如限制修饰系统）最重要的区别在于：CRISPR/Cas系统具有记忆性，细菌会记忆首次入侵外源核酸的信息，在其再次入侵时，特异性的识别并切割这些外源核酸酶使其降解，保护自身遗传物质的完整准确[1]。特异的Cas蛋白会识别外源性的遗传物质中具有原型间隔序列毗邻区（protospacer adjacent motifs，PAM）的DNA片段，通过Cas蛋白将PAM5′端的DNA（即原型间隔序列）加工成短的DNA片段，插入到其CRISPR序列的重复序列之间，最终使得细菌通过spacer序列识别并且随后靶向这些外来原件进行切除[2]。

类型ⅡCRISPR/Cas系统组成最为简单，只需要Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA、RNaseⅢ四种成分即可发挥作用[3]。在这一系统中，Cas9蛋白在crRNA的加工以及对外源DNA的特异性切割中都发挥着重要的作用[4]。因此本综述也主要介绍针对类型ⅡCRISPR/Cas改造而来的相关技术。

1 CRISPR/Cas系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台

CRISPR/Cas系统作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点在于操作简单，这是因为其识别的特异性是有crRNA序列决定的。有报道称，可以通过人工合成crRNA序列使得Cas9系统识别并结合到与该crRNA互补的DNA序列上，最终介导Cas9蛋白特异性的切割该杂交区域[5]。与crRNA互补的靶位点序列称为原型间隔序列，除了与crRNA存在互补序列外，在互补序列的毗邻区还必须存在原型间隔序列毗邻区（proto-spacer adjacent motif，PAM）。PAM序列对于Cas9系统能够有效稳定的发挥作用有着重要的意义，其使得双链RNA复合体与靶序列精准的结合，并有效地避免了自身结合现象的发生。

在Cas9系统发挥识别剪切过程中，tracrRNA首先与crRNA形成crRNA：tracrRNA复合体，Cas9蛋白识别并与crRNA：tracrRNA复合体结合，在crRNA的引导下识别并切割靶位点。为了进一步简化操作过程，研究人员依据cr-RNA：tracrRNA复合体的结构特征设计了sgRNA（single guide RNA），sgRNA具备crRNA：tracrRNA复合体的功能，能够被Cas9蛋白识别并引导Cas9蛋白结合于靶位点[5]。

上述Cas9所具有的这些优点使得其能够成为一种跨平台的基因编辑工具在多种实验模型中发挥价值。最新的研究结果显示，Cas9作为一种基因组编辑工具已经成功的应用在细菌、酵母、植物、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠和人的细胞模型之中（既包括传代细胞系和干细胞中）[5-7]{Cong，2013#427}{Cong，2013#427}{Mali，2013#409}{Mali，2013#409} {Cong，2013#425}{Cong，2013#425}{Cong，2013#425}。这说明了它是一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编辑工具。Cas9-sgRNA在靶位点切割产生双链DNA断裂（Double strand break，DSB）后，细胞可以通过两种方式对DNA进行修复，非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）修复方式和同源重组方式（homology-directed repair，HDR）。非同源末端连接往往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因会丧失功能[8-9]。而同源重组往往通过供体DNA与基因组DNA之间的同源重组造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因[8-9]。

由于sgRNA对靶序列识别的长度只有20个碱基，且Cas9蛋白对sgRNA 5′端序列与靶位点的错配不敏感，这使得Cas9-sgRNA技术的脱靶率比较高。为了提高该技术打靶的特异性，一种突变型的Cas9蛋白（Cas9 D10A）被构建出来[8-9]。这种突变型的Cas9核酸内切酶是将Cas9蛋白的两个核酸内切酶结构域之中的一个（RuvC-Ⅰ）经过点突变的从而失活，另一个切割结构域被保留，从而使得目标序列形成单链断裂（nicked DNA）[5]。这样需要有结合于两条互补的DNA链上相邻位置的一对sgRNA同时引导Cas9 D10A识别并切割靶位点才能造成DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了Cas9-sgRNA技术的特异性[8-9]。

2 利用Cas9系统在转录水平对基因表达的调节

Cas9-sgRNA作为一种能够与靶位点特异性识别并切割的技术，其用途不仅限于对靶位点的靶向编辑。通过点突变使Cas9蛋白的两个核酸内切酶结构域活性全部丧失获得dCas9，但是dCas9仍保留了与靶位点特异性结合的能力，这样将dCas9-sgRNA作为与DNA特异性识别的平台，同样具有很大的应用价值[5，10]。dCas9-sgRNA结合与DNA上，阻断该位点上基因的转录，可以起到转录抑制的效果。如果在dCas9的C端融合转录抑制结构域KRAB（Krüppel associated box），获得的dCas9-KRAB-sgRNA具有更强的转录抑制效果，将可以替代脱靶效应明显的siRNA技术。如果在dCas9的C端融合转录激活结构域p65AD，则可获得能激活特定基因转录的转录因子[10]。通过以上这两个方面的改造可以使Cas9-sgRNA成为对基因表达的调控工具。由于原核表达系统中，需要依赖于诱导与阻遏调控机制，相反，真核生物中，调控的方式是散在的协同调控方法。所以当我们设计在原核生物中表达一个真核生物的基因或是在真核生物中表达一个原核生物的基因时，这就需要在基因序列前附加一个新的启动子和具有调控作用的小分子进行转录水平的调控，甚至需要对于特定的基因序列设计相应的增强子来对于目标基因的表达进行调控，而利用dCas9-激活或抑制系统就可以绕过这些繁琐的步骤[11-13]。

3 利用Cas9系统对目标RNA序列进行操纵

最近，相关研究证明了病原体Francisella novicida基因组中编码的Cas9核酸内切酶能够引起一个位点特异性的转录抑制作用[14]。该文章报道了通过tracrRNA和一种新型的小RNA（small CRISPR/Cas-associated RNA，scaRNA）所介导，F.novicida Cas9（FnCas9）能够与靶向的mRNA相结合，从而进一步发生反应的过程。随后，这种Cas9-scaRNA-tracrRNA-mRNA复合结构的各组分之间互作导致了mRNA稳定性衰减从而将靶序列的表达量降低。以此可以推测FnCas9或可能其他的Cas9系统将可以很容易的被介导靶向RNA。事实上，实验还为研究Cas9系统优先靶向RNA或DNA的机制方面提供了启发，也就是FnCas9系统作为Cas9系统的一个个例，具有较强的结构特异性和序列需求性。

FnCas9系统靶向特定的RNA序列原理做出第一种推测是，FnCas9系统自身结构的特殊性决定了功能。在目前已知的蛋白结构中没有一个是可以通过保守残基与靶向mRNA结合的[14]。相反，在FnCas9系统中存在一个精氨酸富集基元（arginine-rich motif，ARM）结构域，并被证明是在其结合mRNA的过程中发挥了重要的作用[12]。FnCas9系统可能在tracrRNA和mRNA中间形成了一个简单的脚手架结构，这个结构促使了靶向的核酸内切酶对目标区域RNA的降解[15]。另一种推测是介导RNA和靶向RNA之间的非同源性互作下进行识别并结合。实验证实，这个现象在病原体F.novicida中出现，tracrRNA上与mRNA反向互补的同源序列和非同源序列相互交错结合，从而形成tracr-RNA-mRNA复合物。

这项新的技术一经提出，预示着FnCas9将会代替shRNA（short hairpin RNA）/siRNA等传统RNAi（small interfering RNA）技术成为一种新型的RNA干扰物而对于不同种类的细胞及动物模型中特定的基因的下游产物进行RNA干扰[16]。在目前的研究成果看来，并不能确定此系统能否稳定地在真核生物的细胞之中都能发挥降解RNA的作用[23]。当然，FnCas9系统也并不是唯一一个能够与mRNA结合产生干扰作用的Cas9系统一种存在于Pyrococcus furiosus的CRISPR/Cas蛋白亚型（Ⅲ型）被证明可以靶向消化RNA底物[16]。研究发现，与先前提到的FnCas9相比，这一系统所能够识别并干扰的RNA序列更长，也就表明，这一系统与基于Cas9系统的FnCas9干扰物相比有更高的特异性，这一平台的发现将极大促进RNAi技术的进步。

4 展望及结语

到目前为止对CRISPR/Cas9技术的开发尚属初步。首先，虽然Cas9系统会被sgRNA引导从而识别出靶序列，但脱靶效应依然存在[11]。为了减少脱靶效应，研究人员得出了很多方法改变现状，如通过改变sgRNA的二级结构、改变sgRNA的长度、或是通过互补的切口酶预先制造双链DNA断裂，这都能有效地减少脱靶效应[11，17-19]。另外，PAM区域与靶片段的同源序列的长短也在近期被报道，在对于Neisseriameningitidis中的Cas9系统（NmCas9）的PAM序列的特异性分析的报道中我们就可以发现，NmCas9系统的PAM区域（5′-NNNNGATT-3′）与Streptococcus thermophilus中的Cas9系统的PAM区域（5′-NNAGAAW-3′）比Streptococcus pyogenes Cas9（5′-NGG-3′）对PAM区域配对的要求严格的多[5，8，20]。

从最开始认识到CRISPR作为细菌和古细菌的一种免疫系统，到之后通过观察到这种获得性的免疫能力的细菌或是古细菌也能够生存下来并能将免疫能力传递给下一代，认识到CRISPR/Cas9是一种能够遗传的免疫系统，这完美地验证了拉马克的获得性遗传理论[21]。通过这种在原核生物中发现的遗传物质靶向操作系统，现在能够很快速地对遗传物质进行操作或修饰，无论是在细胞系中还是在模式动物的胚胎中[22]。CRISPR/Cas9系统在基因治疗方面能够发挥较大的作用。通过导入Cas9系统和相应的靶向致病基因的sgRNA载体，来对遗传缺陷进行纠正或删除，这种技术将在未来几十年之内将会逐步成为一种可靠地治疗手段。当然，与成熟的ZFN和TALEN等遗传物质靶向编辑系统相比，CRISPR/Cas9核酸内切酶系统具有得天独厚的优越性，其优越性体现在如构建简单方便快捷、安全性高、毒性小等方面。CRISPR/Cas9系统在临床治疗、基础理论研究和农牧渔业等领域必将会发挥巨大的作用，并且将会对分子生物学研究和基因治疗领域产生深远的影响。

[1]Wiedenheft B，Sternberg SH，Doudna JA.RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea[J].Nature，2012，482（7385）：331-338.

[2]Yosef I，Goren MG，Qimron U.Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in Escherichia coli[J].Nucleic acids research，2012，40（12）：5569-5576.

[3]Makarova KS，Grishin NV，Shabalina SA，et al.A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes：computational analysis of the predicted enzymatic machinery，functional analogies with eukaryotic RNAi，and hypothetical mechanisms of action[J]. Biology direct，2006，1（1）：7.

[4]Deltcheva E，Chylinski K，Sharma CM，et al.CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNaseⅢ[J]. Nature，2011，471（7340）：602-607.

[5]Jinek M，Chylinski K，Fonfara I，et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science，2012，337（6096）：816-821.

[6]Hou Z，Zhang Y，Propson NE，et al.Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseriameningitides[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110（39）：15644-15649.

[7]Nekrasov V，Staskawicz B，Weigel D，et al.Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease[J].Nature Biotechnology，2013，31（8）：691-693.

[8]Mali P，Yang L，Esvelt KM，et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9[J].Science，2013，339（6121）：823-826.

[9]Cong L，Ran FA，Cox D，etal.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science，2013，339（6121）：819-823.

[10]Qi LS，Larson MH，Gilbert LA，et al.Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression[J].Cell，2013，152（5）：1173-1183.

[11]Mali P，Aach J，Stranges PB，et al.CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering[J].Naturebiotechnology，2013，31（9）：833.

[12]Cheng AW，Wang H，Yang H，et al.Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on，an RNA-guided transcriptional activator system[J].Cell Research，2013，23（10）：1163-1171.

[13]Perez-Pinera P，Kocak DD，Vock ley CM，et al.RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors[J].Nature methods，2013，10（10）：973-976.

[14]Sampson TR，Saroj SD，Llewellyn AC，etal.A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence[J].Nature，2013，497（7448）：254-257.

[15]Makarova KS，Aravind L，Wolf YI，etal.Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems[J].Biol Direct，2011，6（1）：38.

[16]Hale CR，Zhao P，Olson S，et al.RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex[J].Cell，2009，139（5）：945-956.

[17]Cradick TJ，Fine EJ，Antico CJ，et al.CRISPR/Cas9 systems targetingβ-globin and CCR5 geneshavesubstantialoff-targetactivity[J]. Nucleic Acids Research，2013，41（20）：9584-9592.

[18]Pattanayak V，Lin S，Guilinger JP，etal.High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity[J].Nature biotechnology，2013，31（9）：839-843.

[19]Hsu PD，Scott DA，Weinstein JA，et al.DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases[J].Nature biotechnology，2013，31（9）：827-832.

[20]Deveau H，Barrangou R，Garneau JE，et al.Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus[J]. Journal of Bacteriology，2008，190（4）：1390-1400.

[21]Koonin EV，Wolf YI.Is evolution Darwinian or/and Lamarckian?[J]. Biology Direct，2009，4（1）：42.

[22]Esvelt KM，Mali P，Braff JL，et al.Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing[J].Nature Methods，2013，10（11）：1116-1121.

Review about CRISPR/Cas system as a new targeted genome editing technology

JIA Liangjie
College of Life Sciences,Shaanxi Normal University,Shaanxi Province,Xi′an 710119,China

CRISPR(clustered,regularly interspaced,short,palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)systems are a unique prokaryotic defense against foreign genetic elements.It also be considered as a targeted genome editing tool in molecular biology research.Because of its simplicity,high success rate and high efficiency in genome targeting,Cas system became the best genome targeting tools compared with ZFNs(Zinc-finger nucleases)and TALENs(Transcription activator-like effector nucleases).According to the recent researches,Cas system could be used as an efficient system for site-specific transcriptional repression or activation.Additionally,a specific Cas9 protein has been observed to target an RNA substrate,suggesting that Cas9 may have the same ability as RNAi technology to be programmed to target RNA aswell.Overall,the targeted genome editing technology via CRISPR/Cas system has been Widely promoted and applied in many field such as the research on gene functions,the the diseasemodel of gene knock-out animal construction and the gene therapy.So itwill have significant impacton future advancements in genome engineering.

Gene targeting;Cas9;CRISPR/Cas;Genome editing;Gene therapy

Q78

A

1673-7210（2014）08（a）-0154-04

2014-05-12本文编辑：卫轲）

国家级大学生创新创业训练计划项目（编号201310718020）。