AOTF近红外光谱技术在淫羊藿提取过程在线检测中的应用

许定舟等

[摘要] 目的 研究声光可调滤光器（AOTF）近红外光谱技术，以实现淫羊藿提取过程的在线检测。 方法 采用AOTF近红外光谱仪，在淫羊藿提取的生产过程中实时采集近红外光谱，实时取样，采用紫外分光光度法进行离线检测。通过一阶微分 PLS算法建立校正模型，利用外部验证和内部验证的方法考察模型预测的准确性。 结果 分别对提取过程3次煎煮提取液总黄酮含量建立模型，其相关系数分别为0.9699、0.9811、0.9059，内部验证的平均偏差为-0.28%、-0.21%、1.43%，外部验证的平均偏差分别为-0.72%、-0.26%、3.54%。 结论 AOTF近红外光谱技术可有效地应用于淫羊藿提取过程的在线检测和质量控制。

[关键词] 声光可调滤光器；近红外光谱；在线检测；淫羊藿

[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）08（b）-0004-04

[Abstract] Objective To study the near-infrared spectroscopy technology of acousto-optic tunable filter （AOTF） in order to achieve online detection for Epimedium brevicornum Maxim extracting process. Methods Near infrared spectrometer of AOTF was used to real-time collect near-infrared spectroscopy in production process of Epimedium brevicornum Maxim extraction.Offline detection was conducted by real-time sampling，ultraviolet spectrophotometry.The calibration s was created by first-order differential PLS algorithm，the accuracy of model prediction was inspected by the method of external validation and internal validation. Results The model of total flavonoids content of 3 times decoction extract of extracting process was built respectively，and correlation coefficient was respectively 0.9699，0.9811，0.9059， the average deviations of internal validation respectively was -0.28%，-0.21%，1.43%， the average deviations of external validation respectively was -0.72%，-0.26%，3.54%. Conclusion AOTF near-infrared spectroscopy technology can be effectively applied to online detection and quality control for Epimedium brevicornum Maxim extract process.

[Key words] Acousto-optic tunable filter；Near-infrared spectroscopy；Online detection；Epimedium brevicornum Maxim

淫羊藿为小檗科植物，具有很高的药用价值，味辛、甘，温，归肝、肾经，主治功能：补肾阳，强筋骨，祛风湿。其提取液中主要含有黄酮类化合物、木脂素、生物碱、挥发油等[1]。对淫羊藿提取液的评价主要以其中总黄酮的含量为标准，总黄酮的含量检测以分光光度法计算而得。如要进一步得到其中淫羊藿苷的含量则需要使用高效液相色谱法[2]，此种方法需要消耗大量药品及试剂，检测时间较长，检测结果滞后，不能满足现代化大生产在线质量控制的需求。药物制剂质量的控制不仅对最终产品进行质量控制，更要对整个工艺流程中内单元环节的产品实现动态实时在线的质量控制[3]。

近红外光谱技术是近年来迅速发展的被推广应用的一种分析技术[4-5]，作为一种在线检测技术，具有快速无损的特点，已在众多领域得到广泛应用[6]，在医药领域已有大量文献介绍了近红外光谱技术在这方面的应用[7-10]。声光可调滤光器（acousto-optic tunable filter，AOTF）是利用超声波与特定的晶体作用而产生分光的光电器件，与通常的单色器相比，光学系统无移动部件，波长切换快，重现性好，程序化的波长控制使这种仪器的应用具有更大的灵活性[11]。本研究以AOTF近红外光谱仪在线采集提取工艺阶段管道中淫羊藿提取液的近红外光谱，建立定量模型并预测，研究近红外光谱技术对中药质控中快速检测及如何保障中药产品质量的稳定均一性进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Lumunnar 3060型近红外光谱仪（美国Brimrose公司），The Unscrambler 多元定量软件，UV-2550紫外可见分光光度计（岛津）。淫羊藿由广州陈李济药厂提供。

1.2 方法

1.2.1 中试生产工艺 将淫羊藿25 kg/罐投入多能提取罐，加水提取3次，第1次提取的加15倍量水，第2、3次均加10倍量水，各沸腾1 h。提取液经60～100目筛粗，冷却至40～60 ℃，离心液合并，备用。

1.2.2 取样方法 水提前40 min每分钟取一次样，后20 min每5分钟取一次样。每次取样50 ml。

1.2.3 总黄酮检测方法 精密量取淫羊藿水提液0.5 ml，置50 ml容量瓶中。加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含10 μg的溶液，作为对照品溶液。分别取供试品溶液和对照品溶液，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，在270 nm波长处测定吸光度，计算，即得[12]。

1.2.4 光谱采集与处理 光谱采集采用“ratio mode”通过连接于流体测样器的光纤探头以透视的方式对管道内的淫羊藿水提液进行光谱采集。波长范围1100～2300 nm；波长增量：2.0 nm；扫描次数：200次/s。采用透射检测方式，光程为5 nm。

光谱采用一阶微分9点平滑（savitzy-golay）对原始光谱进行预处理。将经过处理的光谱数据和离线的检测数据相关联，采用偏最小二乘法（PLS），交叉-验证法（cross-validation），用The Uscrambler定量分析软件建立模型。

本研究分别对工艺过程中的第1次煎煮、第2次煎煮、第3次煎煮工艺过程分别建立模型，所采集的近红外光谱图见图1～图3。

2 结果

2.1 模型建立

对光谱进行处理时，发现光谱自1910 nm后的变化趋势明显比较杂乱，所以我们采用1100～1910 nm波段建立模型，经过优化得到定量模型。分析二煎、三煎数据发现，第1批数据与后3批数据相差较大，分别建模验证后发现包含第1批数据进行建模验证偏差较大，由此可初步猜测第1批数据的准确度较差，删除第1批数据重新进行建模，经过优化得到定量模型。3次煎煮的相关系数分别为0.9699、0.9811、0.9059（图4～图6）。

2.2 模型内部验证

利用建立好的模型分别对3次煎煮参与建模的样品进行预测，其内部验证3次预测的平均偏差分别为-0.28%、-0.21%、1.43%。

2.3 模型外部验证

用建立好的模型随机预测5个未参加建模样品，3次煎煮外部验证的平均偏差分别为-0.72%、-0.26%、3.54%（表1）。

3 讨论

中药提取过程中，由于其提取液的成分复杂、环境不断变化、主要成分含量低，因此对其质量的全程在线检测和控制一直是中药成产的难题[13-14]。我国中药制剂水平整体低下，生产模式和管理水平相对落后，质量控制的方法和手段创新不足，导致中药产品质量难以保证，极大地阻碍了中药现代化和国际化的进程[15]。

本研究采用AOTF近红外光谱技术，通过改造光谱采集系统，直接对提取管道流动的提取液进行实时在线采集，建立了淫羊藿总黄酮含量的在线检测模型，模型的预测效果良好，能够满足淫羊藿提取过程在线检测的要求。

淫羊藿的提取工艺包含3次煎煮，研究中发现将3次单元操作所采集的光谱和离线检测数据建立模型，其预测效果明显降低。分析原因可能是每次煎煮过程提取罐内的环境变化较大，对模型具有一定的影响，所以本研究分别建立3个模型对每次煎煮环节的总黄酮含量进行预测，预测准确性明显提高。3次煎煮模型的预测能力随着提取罐内总黄酮含量的降低而降低，也体现了预测能力对样品浓度的要求。

批次性差异较明显，经过对本研究采用的4个批次样品进行PCA定性分析，发现4个批次在主成分空间分布区分较明显，说明4个批次样品之间有差异，这就造成了综合所有样品进行建模时验证偏差远高于单个批次建模的偏差。在后期的研究中，将投料的原料批次、产地等因素综合考虑建模，减小系统误差。后期模型维护需要加大数据采集量，以丰富模型梯度，使模型更加丰满，梯度得以展开，使模型适应性更好、更准确。

综上所述，本研究为ATOF近红外光谱技术应用于淫羊藿及中药制剂生产过程的质量控制提供了参考。

[参考文献]

[1] 林新，李文魁，肖培根.淫羊藿研究的新进展[J].中国药学杂志，1997，23（8）：449-452.

[2] 陈肖家，张庆文，季晖，等.紫外分光光度法和高效液相色谱法测定淫羊藿总黄酮含量的比较研究[J].药物分析杂志，2007，27（5）：625-630.

[3] U.S.Food and drug administration.Guidance for industry PAT：a framework for innovative pharmaceutical development，manufacturing and quality assurance，2004[EB/OL].http：//www.fda.gov/downloads/drugs/guidance compliance regulatory information/guidances/ucm070305.pdf

[4] 陆婉珍，袁洪福，徐广通，等.现代近红外光谱分析技术[M].北京：中国石化出版社，2000.

[5] 屈凌波，陈国广，盛龙生，等.近红外光谱技术及其在药物分析中的应用[J].药物分析杂志，1996，16（3）：204-206.

[6] 褚小立，袁洪福，陆婉珍.在线近红外光谱过程分析技术及其应用[J].现代科学仪器，2004，（2）：3-21.

[7] 严衍禄，赵龙莲，韩东海，等.近红外光谱分析基础与应用[M].北京：中国轻工业出版社，2005：444.

[8] 王艳龙，王胜宝，李新生.近红外光谱技术在农业领域的应用及展望[J].安徽农学通报，2012，18（33）：33-37.

[9] 刘多强，李长征，孙建章，等.近红外光谱技术的发展及在石化领域中的应用[J].化工时刊，2011，25（6）：32-34.

[10] 张玉华，孟一，张应龙，等.近红外光谱技术在食品安全领域应用研究进展[J].食品科技，2012，37（10）：283-286.

[11] 何智慧，练文柳，陈亚光，等.光谱采集方式对AOTF分析烟草主要化学成分的影响[J].分析实验室，2005，24（6）：24-28.

[12] 国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：307.

[13] 杨辉华，王勇，吴云鸣，等.丹参多酚酸盐柱层析过程的近红外光谱在线检测及质量控制[J].中成药，2008，30（3）：409.

[14] 肖雪，梁琼麟，王义明，等.近红外光谱技术在医药领域中的应用进展[J].现代仪器，2011，5（17）：9-12.

[15] 饶毅，魏惠珍，方少敏，等.近红外光谱技术在中药制药过程质控中的应用[J].中成药，2011，33（1）：126-130.

（收稿日期：2014-06-27 本文编辑：许俊琴）

1.2.2 取样方法 水提前40 min每分钟取一次样，后20 min每5分钟取一次样。每次取样50 ml。

1.2.3 总黄酮检测方法 精密量取淫羊藿水提液0.5 ml，置50 ml容量瓶中。加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含10 μg的溶液，作为对照品溶液。分别取供试品溶液和对照品溶液，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，在270 nm波长处测定吸光度，计算，即得[12]。

1.2.4 光谱采集与处理 光谱采集采用“ratio mode”通过连接于流体测样器的光纤探头以透视的方式对管道内的淫羊藿水提液进行光谱采集。波长范围1100～2300 nm；波长增量：2.0 nm；扫描次数：200次/s。采用透射检测方式，光程为5 nm。

光谱采用一阶微分9点平滑（savitzy-golay）对原始光谱进行预处理。将经过处理的光谱数据和离线的检测数据相关联，采用偏最小二乘法（PLS），交叉-验证法（cross-validation），用The Uscrambler定量分析软件建立模型。

本研究分别对工艺过程中的第1次煎煮、第2次煎煮、第3次煎煮工艺过程分别建立模型，所采集的近红外光谱图见图1～图3。

2 结果

2.1 模型建立

对光谱进行处理时，发现光谱自1910 nm后的变化趋势明显比较杂乱，所以我们采用1100～1910 nm波段建立模型，经过优化得到定量模型。分析二煎、三煎数据发现，第1批数据与后3批数据相差较大，分别建模验证后发现包含第1批数据进行建模验证偏差较大，由此可初步猜测第1批数据的准确度较差，删除第1批数据重新进行建模，经过优化得到定量模型。3次煎煮的相关系数分别为0.9699、0.9811、0.9059（图4～图6）。

2.2 模型内部验证

利用建立好的模型分别对3次煎煮参与建模的样品进行预测，其内部验证3次预测的平均偏差分别为-0.28%、-0.21%、1.43%。

2.3 模型外部验证

用建立好的模型随机预测5个未参加建模样品，3次煎煮外部验证的平均偏差分别为-0.72%、-0.26%、3.54%（表1）。

3 讨论

中药提取过程中，由于其提取液的成分复杂、环境不断变化、主要成分含量低，因此对其质量的全程在线检测和控制一直是中药成产的难题[13-14]。我国中药制剂水平整体低下，生产模式和管理水平相对落后，质量控制的方法和手段创新不足，导致中药产品质量难以保证，极大地阻碍了中药现代化和国际化的进程[15]。

本研究采用AOTF近红外光谱技术，通过改造光谱采集系统，直接对提取管道流动的提取液进行实时在线采集，建立了淫羊藿总黄酮含量的在线检测模型，模型的预测效果良好，能够满足淫羊藿提取过程在线检测的要求。

淫羊藿的提取工艺包含3次煎煮，研究中发现将3次单元操作所采集的光谱和离线检测数据建立模型，其预测效果明显降低。分析原因可能是每次煎煮过程提取罐内的环境变化较大，对模型具有一定的影响，所以本研究分别建立3个模型对每次煎煮环节的总黄酮含量进行预测，预测准确性明显提高。3次煎煮模型的预测能力随着提取罐内总黄酮含量的降低而降低，也体现了预测能力对样品浓度的要求。

批次性差异较明显，经过对本研究采用的4个批次样品进行PCA定性分析，发现4个批次在主成分空间分布区分较明显，说明4个批次样品之间有差异，这就造成了综合所有样品进行建模时验证偏差远高于单个批次建模的偏差。在后期的研究中，将投料的原料批次、产地等因素综合考虑建模，减小系统误差。后期模型维护需要加大数据采集量，以丰富模型梯度，使模型更加丰满，梯度得以展开，使模型适应性更好、更准确。

综上所述，本研究为ATOF近红外光谱技术应用于淫羊藿及中药制剂生产过程的质量控制提供了参考。

[参考文献]

[1] 林新，李文魁，肖培根.淫羊藿研究的新进展[J].中国药学杂志，1997，23（8）：449-452.

[2] 陈肖家，张庆文，季晖，等.紫外分光光度法和高效液相色谱法测定淫羊藿总黄酮含量的比较研究[J].药物分析杂志，2007，27（5）：625-630.

[3] U.S.Food and drug administration.Guidance for industry PAT：a framework for innovative pharmaceutical development，manufacturing and quality assurance，2004[EB/OL].http：//www.fda.gov/downloads/drugs/guidance compliance regulatory information/guidances/ucm070305.pdf

[4] 陆婉珍，袁洪福，徐广通，等.现代近红外光谱分析技术[M].北京：中国石化出版社，2000.

[5] 屈凌波，陈国广，盛龙生，等.近红外光谱技术及其在药物分析中的应用[J].药物分析杂志，1996，16（3）：204-206.

[6] 褚小立，袁洪福，陆婉珍.在线近红外光谱过程分析技术及其应用[J].现代科学仪器，2004，（2）：3-21.

[7] 严衍禄，赵龙莲，韩东海，等.近红外光谱分析基础与应用[M].北京：中国轻工业出版社，2005：444.

[8] 王艳龙，王胜宝，李新生.近红外光谱技术在农业领域的应用及展望[J].安徽农学通报，2012，18（33）：33-37.

[9] 刘多强，李长征，孙建章，等.近红外光谱技术的发展及在石化领域中的应用[J].化工时刊，2011，25（6）：32-34.

[10] 张玉华，孟一，张应龙，等.近红外光谱技术在食品安全领域应用研究进展[J].食品科技，2012，37（10）：283-286.

[11] 何智慧，练文柳，陈亚光，等.光谱采集方式对AOTF分析烟草主要化学成分的影响[J].分析实验室，2005，24（6）：24-28.

[12] 国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：307.

[13] 杨辉华，王勇，吴云鸣，等.丹参多酚酸盐柱层析过程的近红外光谱在线检测及质量控制[J].中成药，2008，30（3）：409.

[14] 肖雪，梁琼麟，王义明，等.近红外光谱技术在医药领域中的应用进展[J].现代仪器，2011，5（17）：9-12.

[15] 饶毅，魏惠珍，方少敏，等.近红外光谱技术在中药制药过程质控中的应用[J].中成药，2011，33（1）：126-130.

（收稿日期：2014-06-27 本文编辑：许俊琴）

1.2.2 取样方法 水提前40 min每分钟取一次样，后20 min每5分钟取一次样。每次取样50 ml。

1.2.3 总黄酮检测方法 精密量取淫羊藿水提液0.5 ml，置50 ml容量瓶中。加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含10 μg的溶液，作为对照品溶液。分别取供试品溶液和对照品溶液，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，在270 nm波长处测定吸光度，计算，即得[12]。

1.2.4 光谱采集与处理 光谱采集采用“ratio mode”通过连接于流体测样器的光纤探头以透视的方式对管道内的淫羊藿水提液进行光谱采集。波长范围1100～2300 nm；波长增量：2.0 nm；扫描次数：200次/s。采用透射检测方式，光程为5 nm。

光谱采用一阶微分9点平滑（savitzy-golay）对原始光谱进行预处理。将经过处理的光谱数据和离线的检测数据相关联，采用偏最小二乘法（PLS），交叉-验证法（cross-validation），用The Uscrambler定量分析软件建立模型。

本研究分别对工艺过程中的第1次煎煮、第2次煎煮、第3次煎煮工艺过程分别建立模型，所采集的近红外光谱图见图1～图3。

2 结果

2.1 模型建立

对光谱进行处理时，发现光谱自1910 nm后的变化趋势明显比较杂乱，所以我们采用1100～1910 nm波段建立模型，经过优化得到定量模型。分析二煎、三煎数据发现，第1批数据与后3批数据相差较大，分别建模验证后发现包含第1批数据进行建模验证偏差较大，由此可初步猜测第1批数据的准确度较差，删除第1批数据重新进行建模，经过优化得到定量模型。3次煎煮的相关系数分别为0.9699、0.9811、0.9059（图4～图6）。

2.2 模型内部验证

利用建立好的模型分别对3次煎煮参与建模的样品进行预测，其内部验证3次预测的平均偏差分别为-0.28%、-0.21%、1.43%。

2.3 模型外部验证

用建立好的模型随机预测5个未参加建模样品，3次煎煮外部验证的平均偏差分别为-0.72%、-0.26%、3.54%（表1）。

3 讨论

中药提取过程中，由于其提取液的成分复杂、环境不断变化、主要成分含量低，因此对其质量的全程在线检测和控制一直是中药成产的难题[13-14]。我国中药制剂水平整体低下，生产模式和管理水平相对落后，质量控制的方法和手段创新不足，导致中药产品质量难以保证，极大地阻碍了中药现代化和国际化的进程[15]。

本研究采用AOTF近红外光谱技术，通过改造光谱采集系统，直接对提取管道流动的提取液进行实时在线采集，建立了淫羊藿总黄酮含量的在线检测模型，模型的预测效果良好，能够满足淫羊藿提取过程在线检测的要求。

淫羊藿的提取工艺包含3次煎煮，研究中发现将3次单元操作所采集的光谱和离线检测数据建立模型，其预测效果明显降低。分析原因可能是每次煎煮过程提取罐内的环境变化较大，对模型具有一定的影响，所以本研究分别建立3个模型对每次煎煮环节的总黄酮含量进行预测，预测准确性明显提高。3次煎煮模型的预测能力随着提取罐内总黄酮含量的降低而降低，也体现了预测能力对样品浓度的要求。

批次性差异较明显，经过对本研究采用的4个批次样品进行PCA定性分析，发现4个批次在主成分空间分布区分较明显，说明4个批次样品之间有差异，这就造成了综合所有样品进行建模时验证偏差远高于单个批次建模的偏差。在后期的研究中，将投料的原料批次、产地等因素综合考虑建模，减小系统误差。后期模型维护需要加大数据采集量，以丰富模型梯度，使模型更加丰满，梯度得以展开，使模型适应性更好、更准确。

综上所述，本研究为ATOF近红外光谱技术应用于淫羊藿及中药制剂生产过程的质量控制提供了参考。

[参考文献]

[1] 林新，李文魁，肖培根.淫羊藿研究的新进展[J].中国药学杂志，1997，23（8）：449-452.

[2] 陈肖家，张庆文，季晖，等.紫外分光光度法和高效液相色谱法测定淫羊藿总黄酮含量的比较研究[J].药物分析杂志，2007，27（5）：625-630.

[3] U.S.Food and drug administration.Guidance for industry PAT：a framework for innovative pharmaceutical development，manufacturing and quality assurance，2004[EB/OL].http：//www.fda.gov/downloads/drugs/guidance compliance regulatory information/guidances/ucm070305.pdf

[4] 陆婉珍，袁洪福，徐广通，等.现代近红外光谱分析技术[M].北京：中国石化出版社，2000.

[5] 屈凌波，陈国广，盛龙生，等.近红外光谱技术及其在药物分析中的应用[J].药物分析杂志，1996，16（3）：204-206.

[6] 褚小立，袁洪福，陆婉珍.在线近红外光谱过程分析技术及其应用[J].现代科学仪器，2004，（2）：3-21.

[7] 严衍禄，赵龙莲，韩东海，等.近红外光谱分析基础与应用[M].北京：中国轻工业出版社，2005：444.

[8] 王艳龙，王胜宝，李新生.近红外光谱技术在农业领域的应用及展望[J].安徽农学通报，2012，18（33）：33-37.

[9] 刘多强，李长征，孙建章，等.近红外光谱技术的发展及在石化领域中的应用[J].化工时刊，2011，25（6）：32-34.

[10] 张玉华，孟一，张应龙，等.近红外光谱技术在食品安全领域应用研究进展[J].食品科技，2012，37（10）：283-286.

[11] 何智慧，练文柳，陈亚光，等.光谱采集方式对AOTF分析烟草主要化学成分的影响[J].分析实验室，2005，24（6）：24-28.

[12] 国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：307.

[13] 杨辉华，王勇，吴云鸣，等.丹参多酚酸盐柱层析过程的近红外光谱在线检测及质量控制[J].中成药，2008，30（3）：409.

[14] 肖雪，梁琼麟，王义明，等.近红外光谱技术在医药领域中的应用进展[J].现代仪器，2011，5（17）：9-12.

[15] 饶毅，魏惠珍，方少敏，等.近红外光谱技术在中药制药过程质控中的应用[J].中成药，2011，33（1）：126-130.

（收稿日期：2014-06-27 本文编辑：许俊琴）