基于GSS序列的猴面花miRNA生物信息学研究

李崇奇+周鹏+蔡望伟

基金项目 海南省研究生创新科研课题（Hyb2012-2）；海南医学院科研培育基金（HY2013-18）。

摘要应用miRtour在线分析工具对猴面花GSS序列进行分析，预测猴面花的miRNA序列，应用psrobot预测 miRNA的靶基因。结果发现50条不同的猴面花miRNA成熟序列，尿嘧啶在miRNA 5′端第1碱基出现频率最高，有64条编码序列受到猴面花miRNA的调控。靶基因中有15个编码转录因子，有21个编码酶。

关键词猴面花；miRNA；生物信息学；GSS序列

中图分类号Q74文献标识码A文章编号 1007-5739（2014）11-0345-03

BioinformaticsStudyonmiRNAinMimulusgutatusBasedonGSSSequences

LI Chong-qi 1，2，3ZHOU Peng 2，3CAI Wang-wei 1 *

（1 Department of Biochemistry and Molecular Biology，Hainan Medical College，Haikou Hainan 571199； 2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology/Analysis & Testing Center，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences； 3 College of Agronomy，Hainan University）

AbstractMimulus gutatus miRNA was predicted based on GSS Sequences by miRtour，whereas miRNA-targeted mRNAs were predicted by psrobot. 50 unique mature miRNA sequences were found in which the uracil nucleotide is dominant in the first position of 5′mature miRNAs. 64 mRNAs were regulated by miRNA in which 15 targets was transcription factors，21 targets was enzymes.

Key wordsMimulus gutatus；miRNA；bioinformatics；GSS sequence

miRNA是一类长度为19~24 bp的内源性小RNA分子，其主要通过与靶基因结合后在转录后水平进行基因表达调控。由中介子（Mediator）将RNA聚合酶Ⅱ招募到miRNA基因的启动子后转录miRNA初级转录产物（primary miRNA，pri-miRNA）[1]，然后经历与mRNA相同的加帽、加尾和拼接过程后，形成独特的茎环结构[2]，植物中再在DCL蛋白的作用下加工为miRNA前体序列（precursor-miRNA，pre-miRNA）。miRNA前体序列再经过一些列复杂过程加工为成熟的miRNA序列后，与Argonaute蛋白结合形成RISC复合体后与靶基因结合在转录后水平发挥调控作用。由于miRNA参与了植物器官的发育、代谢的调节和抗逆反应等一系列复杂生物学过程[3]，因而近年来miRNA被广泛应用于植物的遗传品质改良工作。

而猴面花（Mimulus gutatus）为玄参科沟酸浆属草本植物，原产于北美西部，现在世界范围内被广泛栽培。猴面花可用于公园、小区的花坛、花台、花境栽培观赏，也是庭院及居室栽培的优良材料[4]。此外猴面花还是被广泛应用于生态和进化遗传学研究领域的模式生物[5]。本研究拟应用miRtour在线分析工具（http：//bio2server.bioinfo. uni-plovdiv.bg/miRTour/）[6]对猴面花的GSS序列进行分析，识别其miRNA基因和靶基因，为进一步开展猴面花遗传品质改良工作和探讨猴面花独特的生态特点奠定理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biote-chnology Information，NCBI）的网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）的GSS数据库中下载134 919条猴面花序列，另外分别从rfam网站（http：//rfam.sanger.ac.uk/）和pfam网站（http：//pfam.sanger.ac.uk/）下载非编码RNA数据库和蛋白质数据库。

1.2研究方法

将猴面花GSS序列分批递交到miRtour网站上传后参数设置如下：与已知miRNA序列能够比对的最小数量（Minimum number of known miRNAs to be aligned）设置为1，miRNA序列与其互补序列的不配对数（Maximum unpaired nt in miR/miR*）设置为6，其他参数默认。下载分析结果可以得到相应的miRNA序列、前体序列以及前体序列的最小自由能、最小自由能指数等相关参数。然后应用Blast-2.2.27+软件中的blastn程序将预测到的miRNA前体序列与rfam数据库进行比对，应用blastx程序与pfam数据库进行比对，将evalue参数设置为1e-6，去除非miRNA序列，即可得到miRNA前体序列和相应的miRNA序列。将预测到的成熟猴面花miRNA序列以fasta格式上传到psrobot网站（http：//omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/index.php）[7]进行靶基因预测，参数选择严格模式，同时将分值（score）设置为2.5。应用bioedit统计miRNA及其前体的序列长度，然后统计miRNA序列每个位点的碱基组成，对其碱基偏倚进行分析。

2结果与分析

2.1miRNA预测

134 919条猴面花GSS序列经过miRtour分析后共发现72条具有茎环结构的序列，与rfam和pfam数据库比对后发现2条蛋白质序列，去除重复预测miRNA序列后，共预测到50条不同的猴面花miRNA成熟序列（表1）。这50条猴面花miRNA序列隶属于35个不同的miRNA家族，其中成员最多的为miR2607家族，有6个成员。所有前体序列的最小自由能都为负值，最高的为mgu-miR1534，其自由能为-32.64 kJ/mol。前体序列的最小自由能指数为0.70～1.13，GC含量为12.22%～72.51%。

2.2miRNA和前体的碱基组成特征

猴面花miRNA长度为18～23 nt，其中35个miRNA长度为21 nt。miRNA序列中嘌呤与嘧啶的比值为1.00∶0.97，其详细碱基组成A∶G∶C∶U为1.00∶0.89∶0.67∶1.17，胞嘧啶比例明显偏低。同时发现在miRNA 5′端第1~2碱基尿嘧啶的出现频率都最高，分别为42%和60%。而腺嘌呤则在第15碱基、鸟嘌呤在第12和第14碱基、胞嘧啶在第4和第20碱基出现频率最高。miRNA前体长度为90～223 nt，平均长度为179 nt，嘌呤与嘧啶的比值为1.00∶0.99，碱基组成A∶G∶C∶U为1.00∶0.66∶0.51∶1.13，鸟嘌呤和胞嘧啶比例偏低。

2.3miRNA靶基因预测

50个猴面花 miRNA中有25个预测到了靶基因，靶基因数目最多的为mgu-miR156，发现有10条编码序列受其调控（表2）。同时发现共64条编码序列受到猴面花miRNA的调控，大部分基因都受单一miRNA的调控。但发现编码胡萝卜素顺反异构酶的mgv1a008474m 序列受mgu-miR2607a和mgu-miR2607b调控；编码PHO2蛋白的mgv1a001292m同时受mgu-miR399a和mgu-miR399b调控，而且发现mgu-miR399b与mgv1a001292m有3个结合位点分别为637～657、700～720、757～777 nt。靶基因中有15个编码转录因子，主要有SPL转录因子、AP2蛋白、核因子、bHLH DNA结合蛋白和锌指蛋白等；此外还有21条靶基因序列编码酶。

3结论与讨论

GSS序列，又称基因组勘测序列是基因组DNA克隆的一次性部分测序序列，包括随机的基因组勘测序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通过Exon trapped获得的基因组序列、通过Alu PCR 获得的序列以及转座子标记（transposon-tagged）序列等[8]，也被广泛地应用于植物miRNA的预测分析。应用GSS序列识别植物miRNA的数量与其GSS序列数量密切相关，Zhang等[9]在棉花中发现30条miRNA序列，Xie等[10]在欧洲油菜（Brassica napus）8条miRNA序列，罗晓燕等[8]在核果类作物中发现9条miRNA序列，杜江峰等[11]在高粱中发现17条，而李婧等[12]在玉米中仅发现3条。但Wang等[13]对甘蓝（Brassica oleracea）的680 894条GSS序列研究中发现152个miRNA。而本研究中对猴面花134 919条GSS序列研究中共发现50个miRNA，其识别效率与其他基于GSS的研究相差不大。同时在本研究中发现miRNA 5′端第1碱基尿嘧啶的出现频率明显高于其他碱基，这与在拟南芥和水稻的研究一致[14]，目前认为miRNA5′端碱基对于其与选择不同Argonaute蛋白结合形成RISC复合物是至关重要的[15]。然而整体来讲，本研究中识别的猴面花miRNA数量与其真实的miRNA基因数量还有很大的差距，Bartel等[16]认为每个物种的miRNA数量应该达到其基因数量的1%，而事实上mirbase数据库中有些植物的miRNA数量已经达到700余条。因而猴面花的miRNA研究在未来还有待于基于全基因组范围内的生物信息学分析或通过小RNA测序等相关实验技术进行识别。

猴面花在北美西海岸地区为夏末季节开花的多年生植物，而距据此不远的内陆地区却为春季开花的一年生植物，研究表明这主要是由于猴面花对干旱的内陆地区和潮湿高盐的沿海地区适应的结果[17]。Jorgensen等[18]认为SPL转录因子家族可能通过调控开花时间基因的表达决定物种是多年生植物还是一年生植物，同时近来在植物中发现miRNA156家族通过调控SPL转录因子家族决定植物发育时相的转变。而在本研究中也发现miRNA156的靶基因为SPL转录因子，同时还发现mgu-miR1862的靶基因为叶绿体干旱诱导蛋白，但这2个miRNA是否与决定猴面花为多年生植物还是一年生植物直接相关还有待于进一步研究。

4参考文献

[1] KIM Y J，ZHENG B，YU Y，et al.The role of Mediator in small and long noncoding RNA production in Arabidopsis thaliana[J].The EMBO Journal，2011，30（5）：814-822.

[2] WU G.Plant microRNAs and development[J].Journal of Genetics and Genomics，2013，40（5）：217-230.

[3] YANG T W，XUE L G，AN L Z.Functional diversity of miRNA in plants[J].Plant Science，2007，172（3）：423-432.

[4] 徐晔春.花色绚丽的猴面花[J].花木盆景：花卉园艺，2008（8）：2-3.

[5] WU C A，LOWRY D B，COOLEY A M，et al.Mimulus is an emerging model system for the integration of ecological and genomic studies[J].Heredity，2008，100（2）：220-230.

[6] MILEV I，YAHUBYAN G，MINKOV I，et al.miRTour：Plant miRNA and target prediction tool[J].Bioinformation，2011，6（6）：248-249.

[7] WU H J，MA Y K，CHEN T，et al.PsRobot：a web-based plant small RNA meta-analysis toolbox[J].Nucleic Acids Research，2012（W1）：22-28.

[8] 罗晓燕，侍婷，蔡斌，等.核果类果树中microRNAs的生物信息学预测及验证[J].林业科学，2012，48（2）：75-81.

[9] ZHANG B，WANG Q，WANG K，et al.Identification of cotton microRNAs and their targets[J].Gene，2007，397（1-2）：26-37.

[10] XIE F L，HUANG S Q，GUO K，et al.Computational identification of novel microRNAs and targets in Brassica napus[J].FEBS Lett，2007，581（7）：1464-1474.

[11] 杜江峰，武永军，方晓峰，等.生物信息方法预测高粱miRNA及其靶基因[J].中国科学，2010，55（7）：553-561.

[12] 李婧，熊莉丽，胡久梅，等.基于EST和GSS序列的玉米未知微RNA（下转第351页）

（上接第347页）

的数据挖掘[J].生物技术通报，2011（12）：108-112.

[13] WANG J，YANG X，XU H，et al.Identification and characterization of microRNAs and their target genes in Brassica oleracea[J].Gene，2012，505（2）：300-308.

[14] ZHANG B，PAN X，CANNON C，et al.Conservation and divergence of plant microRNA genes[J].Plant J，2006，46（2）：243-259.

[15] THIEME C J，SCHUDOMA C，MAY P，et al.Give It AGO：The Search for miRNA-Argonaute Sorting Signals in Arabidopsis thaliana Indicates a Relevance of Sequence Positions Other than the 5′-Position Alone[J].Front Plant Sci，2012（3）：272.

[16] BARTEL D P.MicroRNAs：Genomics，biogenesis，mechanism，and fun-ction[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[17] LOWRY D B，ROCKWOOD R C，WILLIS J H.Ecological reproductive isolation of coast and inland races of Mimulus guttatus[J].Evolution，2008，62（9）：2196-2214.

[18] JORGENSEN S A，PRESTON J C.Differential SPL gene expression patterns reveal candidate genes underlying flowering time and architec-tural differences in Mimulus and Arabidopsis[J].Mol Phylogenet Evol，2014（73）：129-139.

2.3miRNA靶基因预测

50个猴面花 miRNA中有25个预测到了靶基因，靶基因数目最多的为mgu-miR156，发现有10条编码序列受其调控（表2）。同时发现共64条编码序列受到猴面花miRNA的调控，大部分基因都受单一miRNA的调控。但发现编码胡萝卜素顺反异构酶的mgv1a008474m 序列受mgu-miR2607a和mgu-miR2607b调控；编码PHO2蛋白的mgv1a001292m同时受mgu-miR399a和mgu-miR399b调控，而且发现mgu-miR399b与mgv1a001292m有3个结合位点分别为637～657、700～720、757～777 nt。靶基因中有15个编码转录因子，主要有SPL转录因子、AP2蛋白、核因子、bHLH DNA结合蛋白和锌指蛋白等；此外还有21条靶基因序列编码酶。

3结论与讨论

GSS序列，又称基因组勘测序列是基因组DNA克隆的一次性部分测序序列，包括随机的基因组勘测序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通过Exon trapped获得的基因组序列、通过Alu PCR 获得的序列以及转座子标记（transposon-tagged）序列等[8]，也被广泛地应用于植物miRNA的预测分析。应用GSS序列识别植物miRNA的数量与其GSS序列数量密切相关，Zhang等[9]在棉花中发现30条miRNA序列，Xie等[10]在欧洲油菜（Brassica napus）8条miRNA序列，罗晓燕等[8]在核果类作物中发现9条miRNA序列，杜江峰等[11]在高粱中发现17条，而李婧等[12]在玉米中仅发现3条。但Wang等[13]对甘蓝（Brassica oleracea）的680 894条GSS序列研究中发现152个miRNA。而本研究中对猴面花134 919条GSS序列研究中共发现50个miRNA，其识别效率与其他基于GSS的研究相差不大。同时在本研究中发现miRNA 5′端第1碱基尿嘧啶的出现频率明显高于其他碱基，这与在拟南芥和水稻的研究一致[14]，目前认为miRNA5′端碱基对于其与选择不同Argonaute蛋白结合形成RISC复合物是至关重要的[15]。然而整体来讲，本研究中识别的猴面花miRNA数量与其真实的miRNA基因数量还有很大的差距，Bartel等[16]认为每个物种的miRNA数量应该达到其基因数量的1%，而事实上mirbase数据库中有些植物的miRNA数量已经达到700余条。因而猴面花的miRNA研究在未来还有待于基于全基因组范围内的生物信息学分析或通过小RNA测序等相关实验技术进行识别。

猴面花在北美西海岸地区为夏末季节开花的多年生植物，而距据此不远的内陆地区却为春季开花的一年生植物，研究表明这主要是由于猴面花对干旱的内陆地区和潮湿高盐的沿海地区适应的结果[17]。Jorgensen等[18]认为SPL转录因子家族可能通过调控开花时间基因的表达决定物种是多年生植物还是一年生植物，同时近来在植物中发现miRNA156家族通过调控SPL转录因子家族决定植物发育时相的转变。而在本研究中也发现miRNA156的靶基因为SPL转录因子，同时还发现mgu-miR1862的靶基因为叶绿体干旱诱导蛋白，但这2个miRNA是否与决定猴面花为多年生植物还是一年生植物直接相关还有待于进一步研究。

4参考文献

[1] KIM Y J，ZHENG B，YU Y，et al.The role of Mediator in small and long noncoding RNA production in Arabidopsis thaliana[J].The EMBO Journal，2011，30（5）：814-822.

[2] WU G.Plant microRNAs and development[J].Journal of Genetics and Genomics，2013，40（5）：217-230.

[3] YANG T W，XUE L G，AN L Z.Functional diversity of miRNA in plants[J].Plant Science，2007，172（3）：423-432.

[4] 徐晔春.花色绚丽的猴面花[J].花木盆景：花卉园艺，2008（8）：2-3.

[5] WU C A，LOWRY D B，COOLEY A M，et al.Mimulus is an emerging model system for the integration of ecological and genomic studies[J].Heredity，2008，100（2）：220-230.

[6] MILEV I，YAHUBYAN G，MINKOV I，et al.miRTour：Plant miRNA and target prediction tool[J].Bioinformation，2011，6（6）：248-249.

[7] WU H J，MA Y K，CHEN T，et al.PsRobot：a web-based plant small RNA meta-analysis toolbox[J].Nucleic Acids Research，2012（W1）：22-28.

[8] 罗晓燕，侍婷，蔡斌，等.核果类果树中microRNAs的生物信息学预测及验证[J].林业科学，2012，48（2）：75-81.

[9] ZHANG B，WANG Q，WANG K，et al.Identification of cotton microRNAs and their targets[J].Gene，2007，397（1-2）：26-37.

[10] XIE F L，HUANG S Q，GUO K，et al.Computational identification of novel microRNAs and targets in Brassica napus[J].FEBS Lett，2007，581（7）：1464-1474.

[11] 杜江峰，武永军，方晓峰，等.生物信息方法预测高粱miRNA及其靶基因[J].中国科学，2010，55（7）：553-561.

[12] 李婧，熊莉丽，胡久梅，等.基于EST和GSS序列的玉米未知微RNA（下转第351页）

（上接第347页）

的数据挖掘[J].生物技术通报，2011（12）：108-112.

[13] WANG J，YANG X，XU H，et al.Identification and characterization of microRNAs and their target genes in Brassica oleracea[J].Gene，2012，505（2）：300-308.

[14] ZHANG B，PAN X，CANNON C，et al.Conservation and divergence of plant microRNA genes[J].Plant J，2006，46（2）：243-259.

[15] THIEME C J，SCHUDOMA C，MAY P，et al.Give It AGO：The Search for miRNA-Argonaute Sorting Signals in Arabidopsis thaliana Indicates a Relevance of Sequence Positions Other than the 5′-Position Alone[J].Front Plant Sci，2012（3）：272.

[16] BARTEL D P.MicroRNAs：Genomics，biogenesis，mechanism，and fun-ction[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[17] LOWRY D B，ROCKWOOD R C，WILLIS J H.Ecological reproductive isolation of coast and inland races of Mimulus guttatus[J].Evolution，2008，62（9）：2196-2214.

[18] JORGENSEN S A，PRESTON J C.Differential SPL gene expression patterns reveal candidate genes underlying flowering time and architec-tural differences in Mimulus and Arabidopsis[J].Mol Phylogenet Evol，2014（73）：129-139.

2.3miRNA靶基因预测

50个猴面花 miRNA中有25个预测到了靶基因，靶基因数目最多的为mgu-miR156，发现有10条编码序列受其调控（表2）。同时发现共64条编码序列受到猴面花miRNA的调控，大部分基因都受单一miRNA的调控。但发现编码胡萝卜素顺反异构酶的mgv1a008474m 序列受mgu-miR2607a和mgu-miR2607b调控；编码PHO2蛋白的mgv1a001292m同时受mgu-miR399a和mgu-miR399b调控，而且发现mgu-miR399b与mgv1a001292m有3个结合位点分别为637～657、700～720、757～777 nt。靶基因中有15个编码转录因子，主要有SPL转录因子、AP2蛋白、核因子、bHLH DNA结合蛋白和锌指蛋白等；此外还有21条靶基因序列编码酶。

3结论与讨论

GSS序列，又称基因组勘测序列是基因组DNA克隆的一次性部分测序序列，包括随机的基因组勘测序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通过Exon trapped获得的基因组序列、通过Alu PCR 获得的序列以及转座子标记（transposon-tagged）序列等[8]，也被广泛地应用于植物miRNA的预测分析。应用GSS序列识别植物miRNA的数量与其GSS序列数量密切相关，Zhang等[9]在棉花中发现30条miRNA序列，Xie等[10]在欧洲油菜（Brassica napus）8条miRNA序列，罗晓燕等[8]在核果类作物中发现9条miRNA序列，杜江峰等[11]在高粱中发现17条，而李婧等[12]在玉米中仅发现3条。但Wang等[13]对甘蓝（Brassica oleracea）的680 894条GSS序列研究中发现152个miRNA。而本研究中对猴面花134 919条GSS序列研究中共发现50个miRNA，其识别效率与其他基于GSS的研究相差不大。同时在本研究中发现miRNA 5′端第1碱基尿嘧啶的出现频率明显高于其他碱基，这与在拟南芥和水稻的研究一致[14]，目前认为miRNA5′端碱基对于其与选择不同Argonaute蛋白结合形成RISC复合物是至关重要的[15]。然而整体来讲，本研究中识别的猴面花miRNA数量与其真实的miRNA基因数量还有很大的差距，Bartel等[16]认为每个物种的miRNA数量应该达到其基因数量的1%，而事实上mirbase数据库中有些植物的miRNA数量已经达到700余条。因而猴面花的miRNA研究在未来还有待于基于全基因组范围内的生物信息学分析或通过小RNA测序等相关实验技术进行识别。

猴面花在北美西海岸地区为夏末季节开花的多年生植物，而距据此不远的内陆地区却为春季开花的一年生植物，研究表明这主要是由于猴面花对干旱的内陆地区和潮湿高盐的沿海地区适应的结果[17]。Jorgensen等[18]认为SPL转录因子家族可能通过调控开花时间基因的表达决定物种是多年生植物还是一年生植物，同时近来在植物中发现miRNA156家族通过调控SPL转录因子家族决定植物发育时相的转变。而在本研究中也发现miRNA156的靶基因为SPL转录因子，同时还发现mgu-miR1862的靶基因为叶绿体干旱诱导蛋白，但这2个miRNA是否与决定猴面花为多年生植物还是一年生植物直接相关还有待于进一步研究。

4参考文献

[1] KIM Y J，ZHENG B，YU Y，et al.The role of Mediator in small and long noncoding RNA production in Arabidopsis thaliana[J].The EMBO Journal，2011，30（5）：814-822.

[2] WU G.Plant microRNAs and development[J].Journal of Genetics and Genomics，2013，40（5）：217-230.

[3] YANG T W，XUE L G，AN L Z.Functional diversity of miRNA in plants[J].Plant Science，2007，172（3）：423-432.

[4] 徐晔春.花色绚丽的猴面花[J].花木盆景：花卉园艺，2008（8）：2-3.

[5] WU C A，LOWRY D B，COOLEY A M，et al.Mimulus is an emerging model system for the integration of ecological and genomic studies[J].Heredity，2008，100（2）：220-230.

[6] MILEV I，YAHUBYAN G，MINKOV I，et al.miRTour：Plant miRNA and target prediction tool[J].Bioinformation，2011，6（6）：248-249.

[7] WU H J，MA Y K，CHEN T，et al.PsRobot：a web-based plant small RNA meta-analysis toolbox[J].Nucleic Acids Research，2012（W1）：22-28.

[8] 罗晓燕，侍婷，蔡斌，等.核果类果树中microRNAs的生物信息学预测及验证[J].林业科学，2012，48（2）：75-81.

[9] ZHANG B，WANG Q，WANG K，et al.Identification of cotton microRNAs and their targets[J].Gene，2007，397（1-2）：26-37.

[10] XIE F L，HUANG S Q，GUO K，et al.Computational identification of novel microRNAs and targets in Brassica napus[J].FEBS Lett，2007，581（7）：1464-1474.

[11] 杜江峰，武永军，方晓峰，等.生物信息方法预测高粱miRNA及其靶基因[J].中国科学，2010，55（7）：553-561.

[12] 李婧，熊莉丽，胡久梅，等.基于EST和GSS序列的玉米未知微RNA（下转第351页）

（上接第347页）

的数据挖掘[J].生物技术通报，2011（12）：108-112.

[13] WANG J，YANG X，XU H，et al.Identification and characterization of microRNAs and their target genes in Brassica oleracea[J].Gene，2012，505（2）：300-308.

[14] ZHANG B，PAN X，CANNON C，et al.Conservation and divergence of plant microRNA genes[J].Plant J，2006，46（2）：243-259.

[15] THIEME C J，SCHUDOMA C，MAY P，et al.Give It AGO：The Search for miRNA-Argonaute Sorting Signals in Arabidopsis thaliana Indicates a Relevance of Sequence Positions Other than the 5′-Position Alone[J].Front Plant Sci，2012（3）：272.

[16] BARTEL D P.MicroRNAs：Genomics，biogenesis，mechanism，and fun-ction[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[17] LOWRY D B，ROCKWOOD R C，WILLIS J H.Ecological reproductive isolation of coast and inland races of Mimulus guttatus[J].Evolution，2008，62（9）：2196-2214.

[18] JORGENSEN S A，PRESTON J C.Differential SPL gene expression patterns reveal candidate genes underlying flowering time and architec-tural differences in Mimulus and Arabidopsis[J].Mol Phylogenet Evol，2014（73）：129-139.