响应面法优化鲁氏接合酵母产MAP酶条件

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(湖南农业大学食品科技学院,湖南长沙 410128)

响应面法优化鲁氏接合酵母产MAP酶条件

谢梦琴,王远亮*

(湖南农业大学食品科技学院,湖南长沙 410128)

为研究产MAP酶的最佳培养条件,以鲁氏接合酵母为原料,MAP酶为响应值,在单因素实验的基础上根据Box-behnken实验设计原理,采用三因素三水平的响应面分析法对MAP酶培养条件进行优化,通过响应面实验,建立了MAP酶含量与三个因素变化的二次回归方程。同时根据回归模型进行了计算机模拟实验并绘制了曲面图,探索MAP酶随主要因素水平的变化规律与优化点。结果表明,鲁氏接合酵母产MAP酶最佳培养条件为:温度27℃、盐浓度9.28%、培养时间80.4h,此培养条件下MAP酶浓度3.189ng/mL。

MAP酶,鲁氏接合酵母,响应面分析

促有丝分裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAP酶)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,存在于酵母和哺乳动物细胞中[1]。MAPK链是由MAPKKK、MAPKK和MAPK三类蛋白激酶组成,是酵母菌和动物体内一种重要的信号传递途径[2-3]。生物在受到诸如机械压力、创伤、盐害(渗透压改变)、极端温度等不同的创伤时,均能诱导和激活MAPK链,将不同的细胞膜感受器与细胞应答联系起来,响应各种生物以及非生物胁迫[4]。在现代酱油的酿造很多都是采用高盐稀态的发酵方法,在高盐的环境下,大多微生物都死亡,而耐盐鲁氏接合酵母在酱油后酵过程中产生醇和酯类等与酱油风味及其相关的物质,对酱油独特风味的形成有十分重要的贡献[5-7]。优化鲁式接合酵母产MAP酶条件,对鲁式氏接合酵母应对这种高盐环境很有理论意义。

响应面分析法(response surface methodology)系采用多元二次回归方法作为函数估计的工具,包括实验设计、建立模型、分析模型合理性和寻求最优解等众多实验与统计技术[8]。响应面分析法可以减少实验次数、优化实验条件、提高生产效率、解决生产实际问题。该法在生物培养方面已有广泛应用,韩学易[9]等利用响应面法优化巨大芽孢杆菌产纤维素酶发酵条件后,纤维素酶活力为2.152U/mL,提高了50%。张大皓[10]等利用响应面优化脂肪酶发酵条件,酶活比之前提高了43%。因此,本实验采用单因素实验和Design-Expert软件中的Box-Benhnken设计法、响应面分析方法对鲁氏接合酵母产MAP酶条件优化,为鲁氏接合酵母更好适应酱油后期发酵提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

鲁氏接合酵母 湖南农业大学食品科技学院微生物实验室提供；葡萄糖 北京鼎国有限公司；氯化钠 北京鼎国有限公司；MAP2 ELISA试剂盒 购自SIGMA公司；蜗牛酶 北京鼎国有限公司；PDA培养基:马铃薯汁200g、葡萄糖20g、水1000mL；不同NaCl浓度PDA培养基:分别取2、4、6、8、10、12gNaCl到50mL容量瓶中,用PDA培养基定容至50mL,配制成盐浓度分别为4%、8%、12%、16%、20%、24%的PDA培养基,备用。

SKY-2102C摇床培养箱 国力天(深圳)科技有限公司；TGL-20M冷冻离心机 长沙英泰仪器有限公司；U410-86-80℃冰箱 New Brunswick Scientific Coopration；HH-8数显恒温水浴锅 上海浦东物理光学仪器厂；WellWash4 MK2洗板机 赛默飞世尔科技(中国)有限公司；MB100-2A恒温振荡器 赛默飞世尔科技(中国)有限公司；3001酶标仪 赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 培养方法 鲁氏结合酵母在PDA斜面培养基上30℃培养24～36h,用无菌的生理盐水将其制备成浓度为1×107CFU/mL的菌悬液。100mL三角瓶中装入PDA培养基20mL,按3%接种量接入鲁氏接合酵母菌悬液,转速120r/min,28℃摇床培养48h。

1.2.2 鲁氏结合酵母蛋白的提取 取10mL菌悬液,离心,收集菌体,加入2mL 100mg/L浓度的蜗牛酶将菌沉淀悬起后常温下孵育20min,-80℃冰箱放置10min后,迅速移至37℃水浴箱10min,反复5次左右,离心收集上清液。

1.2.3 MAP酶测定方法 分别在酶标板上设置微管相关蛋白标准品孔12个,每两个孔为一个编号,样品孔1个、空白孔1个,分别在不同编号的标准品孔中分别加入0.6、0.4、0.2、0.1、0.05ng/mL的微管相关蛋白标准品、样品孔中加入样品稀释液40μL和待测样品10μL,空白孔加入50μL样品稀释液,37℃温育30min后,用洗涤液清洗5次,拍干,再往酶标板孔中加入酶标试剂50μL(空白孔除外),37℃温育30min后,洗涤,加入50μL显色剂A和显色剂B,混匀,37℃避光显色15min后,加入终止液50μL,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值),绘制标准曲线并算出各样品浓度。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 温度对MAP酶含量的影响 取PDA培养基5份,在0.3%的接种量,自然pH,盐浓度为8%,转速为120r/min的条件下培养,培养的温度分别为20、24、28、32、36℃,培养3d,用MAP酶联免疫方法测其浓度。

1.2.4.2 时间对MAP酶含量的影响 取PDA培养基5份,在0.3%的接种量,自然pH,盐浓度为8%,温度28℃、转速为120r/min的条件下培养,培养时间分别为2、3、4、5、6d,用MAP酶联免疫方法测其浓度。

1.2.4.3 盐浓度对MAP酶含量的影响 取PDA培养基5份,在0.3%的接种量,自然pH,转速为120r/min的条件下培养,培养的盐浓度分别为0、4%、8%、12%、16%,20%、24%,培养3d,用MAP酶联免疫方法测其浓度。

1.2.5 响应面优化实验设计 采用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-behnken(BBD)中心组合实验设计原理设计响应面实验。根据单因素影响实验结果,选取培养时间、温度及盐浓度3个因素作为实验因素,以MAP酶含量作为响应值,采用三因素三水平的响应面分析方法设计实验,实验因素及水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels of the response surface method

2 结果与分析

2.1 MAP酶标准曲线

以MAP酶浓度为横坐标,OD值为纵坐标,其线性回归方程为:y=5.4928x-0.2422,R2=0.9959。说明曲线可信度较高,可以应用。

图1 MAP酶标准曲线Fig.1 Calibration curve of MAPase

2.2单因素实验结果

2.2.1 培养温度对MAP酶浓度的影响 从图2可以看出,培养温度对MAP酶浓度影响较大,当温度为20～28℃时,随温度增加MAP酶浓度明显增加,在28℃时达到最高,温度28～36℃时MAP酶浓度明显下降。原因是高温影响了鲁氏接合酵母的生长,影响了MAP酶的产生,因此选择温度28℃为宜。

图2 温度对MAP酶浓度的影响Fig.2 Effect of temperature on MAPase concentration

2.2.2 培养时间对MAP酶浓度的影响 从图3可以看出,培养时间对MAP酶浓度影响显著。在8%盐浓度条件下,培养前期的1～3d内,MAP酶浓度随培养时间的延长而逐渐上升；但随着时间的进一步延长,MAP酶在发酵液中的浓度有所下降。因为此时鲁氏接合酵母已经进入生长周期的稳定期,MAP的产量主要受酵母菌活菌影响,故选择培养时间3d为宜。

图3 培养时间对MAP酶浓度的影响Fig.3 Effect of time on MAPase concentration

2.2.3 盐浓度对MAP酶浓度的影响 由图4可知,盐浓度对MAP酶浓度影响十分明显。料液比在0%～8%之间时,MAP酶浓度随盐度的增加而上升,在这样的盐浓度内,可能是由于盐胁迫激活了MAP酶链,产生MAP酶响应这种高盐胁迫,从而产生大量的MAP酶。而随着盐浓度进一步增加,MAP酶含量明显下降,是因为此时盐的浓度已经影响了鲁氏接合酵母菌的生长,因此选择盐浓度为8%。

图4 盐浓度对MAP酶浓度的影响Fig.4 Effect of salt on MAPase concentration

2.3响应面优化实验结果与分析

2.3.1 回归模型的建立及其分析 利用Design-Expert7.1.6统计软件对表2数据进行多项式回归分析,建立鲁氏接合酵母产MAP酶的最适培养条件的回归模型,得到MAP酶活对编码自变量A、B及C的二次多项回归方程。

通过多元回归拟合分析得到以MAP酶浓度为目标函数与各因变量温度,时间,盐浓度的二次回归方程模型:

MAP酶浓度=3.11+0.073A+0.19B+0.19C-0.39AB-0.34AC-0.29BC-0.34A2-0.27B2-0.28 C2

对该模型进行方差分析及模型系数进行显著性检验,结果见表3。p<0.05表示该项指标显著,由表3可知,回归模型极其显著(p<0.0001),说明建立的模型有意义；失拟项p=0.0503>0.05,无显著性差异,说明模型拟合度良好,可用此模型和方程来分析和预测。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Experimental design and results of the response surface method

由表4可知,Y的变异系数CV表示实验的精确度,CV值越高,实验的可靠性越低,本实验中CV=1.96,较低,说明实验操作可信。

表3 响应面方差分析结果Table 3 Result of response surface quadratic model

注:**,p<0.01,差异极显著。

表4 模型的可信度分析Table 4 Analysis for determination of model

2.3.2 响应曲面分析与优化 响应面图是利用软件根据回归方程绘制的,是响应值在各实验因素交互作用下得到的结果构成的一个三维空间曲面,可以预测和检验变量的响应值以及确定变量的相互关系。分析当温度、时间和盐浓度其中有1个因素固定时,另外2个因素及其交互作用对MAP酶浓度的影响。根据回归方程做出模型的响应曲面见图5～图7。

图5 培养温度与时间对MAP酶浓度影响的曲面图Fig.5 The response surface polt for the effects of the temperature and time on MAPase concentration

图6 盐浓度与温度对MAP酶浓度影响的曲面图Fig.6 The response surface polt for the effects of the salt and temperature on MAPase concentration

图7 盐浓度与时间对MAP酶浓度影响的曲面图Fig.7 The response surface polt for the effects of the salt and time on MAPase concentration

响应面图形是响应值对各实验因子X1,X2,X3所构成的三维空间的曲面图,从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。响应面图有顶峰,证实影响因素的最佳值落在实验设计的取值范围内。由响应面图可以看出,在盐浓度一定时,随着时间与温度增加,鲁氏接合酵母中MAP酶浓度先增加后减小；在时间一定时,随着盐浓度与温度增加,鲁氏接合酵母中MAP酶浓度先增加后减小；在温度一定时,随着盐浓度与时间的增加,鲁氏接合酵母中MAP酶先增加后减小。利用Design-Expert7.1.6进行优化处理得到鲁氏接合酵母产MAP酶最优的培养条件为:温度27℃、盐浓度9.28%,培养时间80.4h,此条件下鲁氏结合酵母产MAP酶浓度为3.166ng/mL。

2.3.3 验证实验 根据单因素实验与响应面实验得到的结果,得到鲁氏接合酵母产MAP酶的最优培养条件为温度27℃、盐浓度9.28%、培养时间80.4h,做5组验证实验,得其MAP酶浓度为3.189±0.177ng/mL,预测值与实验值之间具有良好的拟合性,表明模型有效、可靠。

3 结论

本研究是在单因素实验结果基础上,利用响应面法优化鲁氏接合酵母产MAP酶条件,通过对实验结果进行方差分析可知,本实验中对MAP酶浓度的影响程度大小依次为盐浓度>时间>温度。研究结果表明鲁氏接合酵母产MAP酶最佳培养条件为温度27℃、盐浓度9.2%,培养时间80h,此培养条件下鲁氏接合酵母MAP酶的浓度为3.189ng/mL。

[1]Tena G,Asai T,Chiu WL,etal. Plant Mitogen-activated protein kinase signaling cascades[J]. Currentopinion.Plant Biology,2001,74:392-400.

[2]Davis R. Signal transduction by the JNK group of MAP kinase[J]. Cell,2000,103:239-252.

[3]Madhani HD,Fink G R. The riddle of MAP kinase signaling specificity[J]. Trends Genet,1998,14:151-155.

[4]Jonak C.Complexity,cross talk and integration of plant MAP kinase signaling[J]. Current Opinion Plant Biology,2002,5:415-424.

[5]Murooka Y,Yamshita M. Traditional healthful fermented products of Japan[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2008(35):791-798.

[6]Kataoka S.Functional effects of Japanese style fermented soy sauce(Shoyu)and its components[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2005(100):227-234.

[7]Ohata M,Kohama K,Morimitsu Y,etal. The formation mechanism by yeast of the2(or5)-ethy5(or2)-methyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone in Miso[J]. Biosci Biotech Biochem,2007,71:407-413.

[8]Majumder A,Bhandari S,Purama RK,etal. Enhanced production of a novel dextran from Leuconostocmesenteroides NRRL B-640 by response surface methodology[J]. Ann Microbiol,2009,59(2):309-315.

[9]韩学易,唐自钟,胡玉龙,等.响应面优化巨大芽孢杆菌产纤维素酶发酵条件[J].四川农业大学学报,2013,31(3):319-321.

[10]张大皓,谭天伟.响应面实验设计优化脂肪酶发酵培养基[J].北京化工大学学报,2006,33(2):41-44.

Optimization of MAPASE producing fromZygosaccharomycesrouxiiby response surface method

XIEMeng-qin,WANGYuan-liang*

(College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

Using MAPase concentration as the response value,Zygosaccharomycesrouxiias the raw material to study the optimal MAPK conditions. Based on the result of single-factor test,response surface methodology with 3 factors and 3 levels was adopted according to box-behnken experiment design principle. Two regression equations for the influence relationship of MAPase concentration and three varietals factors were established. On the basis of regression models,the results with surface were simulated to give optimized result and trends of the main factors on the educing sugar concentration. The optimal MAPK conditions were as follows:the temperature was 27℃,salt Concentration 9.28%,time 80.4 hours. Under this condition the MAPase concentration was 3.189ng/mL.

MAPase;Zygosaccharomycesrouxii; response surface method

2014-03-05 *通讯联系人

谢梦琴(1989-)，女，硕士，研究方向：食品生物技术。

国家自然基金项目(31000809)。

TS264.2

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001