地塞米松联合淀粉样β蛋白对大鼠海马组织损伤的实验研究

袁晓玲,王景方,任鸿雁,董子峰△,孔辉

(1.聊城市人民医院 神经内科,山东 聊城 252000;2.聊城市东昌府区人民医院 神经内科,山东 聊城 252000;3.南京医科大学,江苏 南京 210029)

地塞米松联合淀粉样β蛋白对大鼠海马组织损伤的实验研究

袁晓玲1,王景方2,任鸿雁1,董子峰1△,孔辉3

(1.聊城市人民医院 神经内科,山东 聊城 252000;2.聊城市东昌府区人民医院 神经内科,山东 聊城 252000;3.南京医科大学,江苏 南京 210029)

目的 探讨地塞米松（dexamethasone，DEX)联合淀粉样β蛋白（amyloidβ-protein，Aβ)对大鼠海马组织的损伤机制。方法 采用水迷宫方法检测DEX联合淀粉样β蛋白对大鼠学习记忆的影响；采用MTT方法检测DEX联合Aβ蛋白对大鼠海马神经元活力的影响作用；采用彗星实验检测DEX联合Aβ蛋白对大鼠海马神经元中DNA的损伤程度。结果 与GC维持+DEX1组比较，GC维持+DEX1+Aβ组第10天的逃避潜伏期和游泳距离均延长，差异具有统计学意义（P＜0.05)。与GC维持+DEX5组比较，GC维持+DEX5+Aβ组第10天的逃避潜伏期显著延长，具有显著性差异（P＜0.01)，第9、10天的游泳距离延长，差异具有统计学意义（P＜0.05)；与GC维持+Aβ组比较，GC维持+DEX1+Aβ组第10天的逃避潜伏期和游泳距离均延长，差异具有统计学意义（P＜0.05)。与GC维持+Aβ组比较，GC维持+DEX5+Aβ组第10天的逃避潜伏期显著延长，具有显著性差异（P＜0.01)，并且第10天游泳距离延长，差异具有统计学意义（P＜0.05)；与溶剂对照组比较，各浓度的DEX分别与不同浓度的Aβ合用时，均会使海马神经元的活力下降，且差异均具统计学意义（P＜0.05)；DEX10+Aβ5组分别与DEX10组和Aβ5组比较，均有较严重彗星拖尾现象，且均具有显著性差异（P＜0.01)。结论 DEX与Aβ合用比单用DEX或Aβ对大鼠学习记忆力下降影响较大；DEX与Aβ合用从细胞水平上会降低海马神经元的活力，单用任何一种均无影响；DEX与Aβ合用会造成海马神经元中DNA损伤.

DEX；淀粉样β蛋白；联合作用；大鼠；海马组织

阿尔茨海默病(alzheimer disease,AD)是一种起病隐匿、进行性发展、发病率高、危害极大的神经系统退行性疾病。Spagnol G等［1］研究表明细胞凋亡可以降低阿尔茨海默病病人脑组织中神经元的数量。有研究［2-3］表明AD的发病机制可能与神经元被淀粉样β蛋白诱导凋亡有关联。AD主要的病理学特征是在细胞内有神经元纤维缠结出现并且在神经元外有老年斑的沉积,老年斑的主要成分是淀粉样β蛋白(amyloid beta protein,Aβ)。Aβ主要通过干扰钙平衡和增强炎症反应等引起神经元异常,在AD的发病和发展中起重要作用［4］。20世纪90年代初有人发现下丘脑-垂体-肾上腺皮质(hypothalamic-pituitary-adrenocortical,HPA)轴功能失调与AD有关。然而,海马神经元中含有大量机体正常分泌的糖皮质激素(glueocortieoids,GC)受体。GC不仅可以穿过血脑屏障发挥生理和药理作用,而且可以促进氧自由基神经元的毒性。AD患者主要表现为循环中的基础糖皮质激素水平显著升高及HPA轴的功能失调［5］,目前出现这一现象的根本作用机制国内外少有报道,因此,本研究通过动物实验与分子水平实验探讨AD发病机制,观察DEX和Aβ联合作用对大鼠学习记忆能力的影响及可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:选取清洁级SD大鼠68只,动物许可证号:SCXK(蒙)2002-0001,购自蒙古大学动物中心,体质量200～250 g,给予正常饲料喂养,雌雄皆可(其中8只为已怀孕18d,用于体外培养海马神经元)。

1.1.2 主要试剂及仪器

Aβ蛋白:Sigma公司;DEX:Sigma公司;低糖DMEM培养基:Invitrogen Life Technologies公司;神经元基础培养液(neurobasal medium,NB):Gibco公司;Morris水迷宫仪:中国医学科学院药物研究所;超净工作台:江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;恒温CO2培养箱:美国Thermo公司(250B型)

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验:分组给药:将60只大鼠随机分为6组,具体分组、用药见表1。

表1 大鼠分组情况列表Tab.1 List of the rats grouping

各组大鼠均给予注射0.2 mg/kg的DEX以维持体内基础GC水平［6］,需要给予Aβ的组别中的大鼠,注射Aβ前1天开始给予DEX,连续注射7 d,GC维持对照组给予等量0.4%乙醇溶媒。等量生理盐水作为DEX的溶媒。DEX+Aβ组中的大鼠于CAl区注射给予4μL的Aβ。注射Aβ后的第5天对大鼠进行水迷宫训练,训练7 d,进行水迷宫实验。

1.2.2 Morris水迷宫实验:Morris水迷宫实验的训练和记录方法参见文献［7］,水迷宫直径为150 cm,水深50cm。每天从不同的象限入水训练2次。第7天开始采用Morrismicrosoft基础类应用程序纪录逃避潜伏期(escape latency)和游泳距离(swiming distance),从以上2个方面来评价大鼠的学习记忆改变［8］。

1.2.3 生化与分子实验

① 海马神经元的培养:参照Santos SF等［9］的方法进行体外海马神经元的培养:将孕18d的大鼠断头处死,取胚胎海马组织,剪成小块,37℃胰蛋白酶消化20min,用含10%胎牛血清的NB洗3次,筛网过滤,计数,置于96孔培养板(每孔5×104个),37℃,5%CO2环境下培养,2～3 d换一次培养液,培养9 d后的海马神经元用于测定细胞活力和彗星实验检测DNA损伤。

②MTT比色法测定细胞活力:将实验分为:单用DEX1组(1 μmol/L),单用 DEX10组(10μmol/L),单用 Aβl(1μmol/L),单用Aβ5(5μmol/L),DEX+Aβ组(1μmol/L DEX+1μmol/LAβ、1 μmol/L DEX+5μmol/LAβ、10 μmol/L DEX+1 μmol/LAβ、10 μmol/L DEX+5μmol/LAβ)体外培养海马神经元到第9天,更换DMEM培养液(不加胎牛血清),继续培养24 h后,加入含0.04%乙醇的无血清DMEM培养液或DEX,继续培养24 h,然后加入无血清DMEM培养液或Aβ,24 h后参照Jun DJ等［10］的方法测细胞存活率。细胞存活率(%)=(A实验组/A对照组)×100%。

③彗星实验检测海马神经元DNA损伤:实验分为:正常对照组(正常培养),单用DEX10组(10μmol/L)组,单用Aβ5组(5 μmol/L),和DEX10+Aβ5组(10 μmol/LDEX+5μmol/L Aβ)。按照相应的浓度不同时间段加入到培养液中培养48 h后,采用彗星实验(单细胞凝胶电泳)检测海马神经元中DNA的损伤,彗星实验具体步骤参考Wang S等［11］研究。

1.3 统计学方法 所有数据结果均采用SPSS17.0统计软件处理,正态计量资料采用t检验或方差分析,计数资料比较采用χ2检验及Fisher精确概率法;规定P＜0.05为有统计学差异,P＜0.01有显著性差异。

2 结果

2.1 DEX与Aβ合用对大鼠学习记忆的影响 与GC维持对照组比较,GC维持+DEX1组及GC维持+DEX5组中大鼠的逃避潜伏期,游泳距离均有所缩小,但不具有显著性差异;与GC维持对照组比较,GC维持+Aβ组中大鼠的逃避潜伏期和游泳距离均有延长趋势,但无统计学意义;与GC维持+DEX1组比较,GC维持+DEX1+Aβ组第10天的逃避潜伏期和游泳距离均延长,差异具有统计学意义(P＜0.05);与GC维持+DEX5组比较,GC维持+DEX5+Aβ组第10天的逃避潜伏期显著延长,具有显著性差异(P＜0.01),第9、10天的游泳距离延长,差异具有统计学意义(P＜0.05);与GC维持+Aβ组比较,GC维持+DEX1+Aβ组第10天的逃避潜伏期和游泳距离均延长,差异具有统计学意义(P＜0.05);与GC维持+Aβ组比较,GC维持+DEX5+Aβ组第10天的逃避潜伏期显著延长,具有显著性差异(P＜0.01),并且第10天游泳距离也延长,差异具有统计学意义(P＜0.05,见表2)。

表2 DEX与Aβ合用对大鼠学习记忆的影响Tab.2 Effect of DEX combined with Aβon learning and memory in rats

2.2 DEX与Aβ合用对海马神经元活力的影响 与溶剂对照组比较,单用DEX和单用Aβ在各浓度值对海马神经元的活力都无影响;与溶剂对照组比较,各浓度的DEX分别与不同浓度的Aβ合用时,都会使海马神经元的活力下降,差异均具统计学意义(P＜0.05);与相同浓度Aβ组比较,各浓度的DEX分别与不同浓度的Aβ合用时,都会使海马神经元的活力下降,差异均具统计学意义(P＜0.05,见表3)。

表3 DEX与Aβ合用对海马神经元活力的影响Tab.3 The impact of DEX combined with Aβon the vitality of hippocampal neurons

2.3 DEX与Aβ合用对海马神经元彗星拖尾长度的影响

表4显示DEX10组对海马神经元有轻度彗星拖尾现象,但与溶剂对照组比较差异无统计学意义;Aβ5组对海马神经元有轻度彗星拖尾现象,差异具有统计学意义(P＜0.05);与溶剂对照组比较,DEX10+Aβ5组有严重彗星拖尾现象,差异具有统计学意义(P＜0.01);与Aβ5组比较,DEX10+Aβ5组有严重彗星拖尾现象,差异具有统计学意义(P＜0.01,见表4),表明DEX10可进一步促进Aβ延长海马神经元彗星拖尾长度,增加海马神经元的损伤。

表4 DEX与Aβ合用对海马神经元DNA损伤的影响(μm)Tab.4 The impact of DEX combined with Aβon DNA damage in hippocampal neurons(μm)

3 讨论

DEX和Aβ的联合损伤作用具有协同或相加作用可能会促进AD的发生和发展。Cheng A等［12］的研究证实,神经元细胞中DNA损伤能够导致神经元凋亡,能够诱导 AD发病。Ge YS等［13］的研究表明,较多的糖皮质激素和Aβ对神经元均有毒性。Kleen JK及其他学者［14-16］的研究表明,糖皮质激素含量的增高会破坏海马神经元树突的完整性,甚至可以导致海马神经元的死亡。然而本研究结合动物水平与分子水平对DEX与Aβ联合作用对大鼠海马组织损伤作用进行研究,从微观到宏观揭示DEX与Aβ联合引起大鼠海马组织损伤的作用机制。

本研究中,大鼠水迷宫实验显示:与GC维持+DEX相应浓度组比较,GC维持+DEX1+Aβ组第10天的逃避潜伏期和游泳距离均有延长;与GC维持+Aβ组比较,GC维持+DEX1、5+Aβ组第10天的逃避潜伏期和游泳距离均有延长;这说明DEX与Aβ合用比单用DEX或Aβ对大鼠学习记忆力下降影响大,这是由于DEX和Aβ联合作用致大鼠海马神经元损伤程度要比单用DEX或Aβ的程度大;MTT实验结果为:单用DEX和单用Aβ无论哪个浓度值对海马神经元的活力均无影响,而当各浓度的DEX分别与不同浓度的Aβ合用时,均会使海马神经元的活力下降,这说明DEX与Aβ合用从细胞水平上会降低海马神经元的活力,单用DEX或Aβ任何一种均对海马神经元的活力无影响,这可能与DEX会增强Aβ干扰钙平衡和增强炎症反应有关,从而引起神经元异常;彗星实验结果为:DEX10+Aβ5组分别与DEX10组和Aβ5组比较,都有较严重彗星拖尾现象,这从DNA水平说明DEX10+Aβ5合用会造成海马神经元损伤,其原因为DEX与Aβ合用会损伤海马神经元中DNA。

总之,DEX与Aβ合用会降低大鼠海马神经元的活力,并且能够损伤海马神经元中的DNA,从而降低大鼠学习记忆能力。此研究对AD的发病机制及预防有一定的实用价值。

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(编校:谭玲)

Experimental study of am yloidβprotein combined w ith dexamethasone on hippocam pal tissue damage

YUAN Xiao-ling1,WANG Jing-fang2,REN Hong-yan1,DONG Zi-feng1Δ,KONG Hui3

(1.Department of Neurology,Liaocheng People's Hospital,Liaocheng 252000,China;2.Dongchangfu People's Hospital of Liaocheng City,Liaocheng 252000,China;3.Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective To explore the damage mechanisms of amyloid β protein combined with dexamethasone(DEX)on hippocampal tissue.Methods Morriswatermaze was used to detect effects of DEX combined with amyloid beta protein on learning and memory in rats.MTTmethod was used to detect influence of DEX combined with Aβprotein on vitality of rat hippocampal neurons.Comet assay was used to detect the damage extent of DEX combined with Aβprotein to rat hippocampal neurons DNA.Results Compared with the GC maintain+DEX1 group,the escape latency and swimming distance of rat in GCmaintain+DEX1+Aβgroups were prolonged on the tenth day,the difference was statistically significant(P＜0.05).Compared with GCmaintain+DEX5 group,the escape latency of GCmaintain+DEX5+Aβgroup was significantly prolonged on the 10th day,there was significant difference(P＜0.01),the swimming distance extension on the 9th and 10th day,the difference was statistically significant(P＜0.05).Compared with GCmaintain+Aβgroup,escape latency and swimming distance of GCmaintain+DEX1+Aβgroups were prolonged,the difference was statistically significant(P＜0.05).Compared with GCmaintain+Aβgroup,the escape latency ofGCmaintain+DEX5+Aβgroup was significantly prolonged on the 10th day,there was significant difference(P＜0.01),the swimming distance extension on the 10th day.Compared with the control group,each concentration of DEX combined with different concentrations of Aβdecreased activity of hippocampal neurons,the differencewas statistically significant(P＜0.05).Compared with the DEX10 group and Aβ5 group respectively,DEX10+Aβ5 group had amore severe comets smearing,there was significant difference(P＜0.01).Conclusion DEX+Aβgroup has greater impact on learning and memory decline than single Aβgroup or single DEX group.On the cellular level,DEX+Aβgroup will reduce the viability of hippocampal neurons,any ofwhich alone had no effect;the combination of DEX and Aβcan cause DNA damage in hippocampal neurons.

DEX;amyloidβ-protein;combination;rat;hippocampus tissue

袁晓玲，女，硕士，主治医师，研究方向：脑血管病方面，E-mail：13963528322@163.com；董子峰，通信作者，男，主治医师，硕士，研究方向：神经内科临床，E-mail：2532644214@qq.com。

R749

A

1005-1678（2014)06-0071-04