运动时间诱导大鼠 Resistin表达差异的研究

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(1.山东科技大学 体育学院， 山东 青岛 266590；2.辽宁师范大学 体育学院, 辽宁 大连 116029)

运动时间诱导大鼠Resistin表达差异的研究

刘淑梅1,王耀光2,李梅月1

(1.山东科技大学 体育学院， 山东 青岛 266590；2.辽宁师范大学 体育学院, 辽宁 大连 116029)

以观察不同运动持续时间对大鼠Resistin蛋白表达的影响为主要研究目的，经2型糖尿病大鼠建模后，将62只正常及糖尿病大鼠分为6组：正常对照组，糖尿病对照组和糖尿病运动4组(20、40、60和80分钟组)。在运动组大鼠进行一次中等强度的跑台运动后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测大鼠蛋白的表达情况。与糖尿病对照组相比表明各运动组Resistin蛋白含量显著下降(Plt;0.01)；与20分钟和40分钟组相比，60分钟组下降的幅度具有显著性差异(Plt;0.01和Plt;0.05)。由此得出结论：持续运动达60分钟的中等强度运动对Resistin蛋白表达的影响好于其他运动时间。

运动持续时间；2型糖尿病大鼠； Resistin

2型糖尿病(T2DM)发病的原因首先表现为胰岛素抵抗(IR)，而了解胰岛素抵抗的生理机制是治疗2型糖尿病的前提。Steppan等人首先发现由脂肪组织分泌的一种活性物质，可降低全身组织对胰岛素的敏感性，致使细胞减少或不再摄入能量、导致血糖和血脂的堆积，并将其命名为Resistin (抵抗素)[1]。最近的研究发现，运动能降低Resistin蛋白的表达并提高胰岛素的敏感性[2][3]。美国的美国运动医学学会(ACSM)和美国的美国糖尿病协会(ADA)2010年推出的2型糖尿病运动指南：“2型糖尿病与运动”推荐的有氧运动时间是每周150分钟(中等强度)，分配到5天中(每天30分钟)[4]。

尽管运动可使Resistin表达的水平下降，但有关使其表达降低的最佳运动持续时间的研究还未见报道。鉴于Resistin与胰岛素敏感性具有密切的关联，因此，了解不同运动持续时间与Resistin表达之间的关系，对选择适宜的运动持续时间、完善运动处方均具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料 实验选用70只健康SD大鼠(平均体重为206±13 g)，由大连医科大学(许可证号 SCXK(辽)2008-0002)实验中心提供。分笼、常规饲养(标准环境)。在适应性喂养1周后进行适应性跑台训练。强度由小至中等。首先随机挑选10只大鼠,设为正常对照组(NC)，其余60只大鼠用于实验建模，制作2型糖尿病模型。

1.2 实验方法

1.2.1 2型糖尿病动物建模 建模方法在参考前人实验的基础上进行了改良[5]。方法是先进行4周高脂饮食,并给予添加3%的果糖的饮水，4周后实施一次性的STZ腹腔注射：标准为30 mg/kg体重，方法是将STZ溶于pH4.4、0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液中。1周后评估大鼠的建模效果。方法是在禁食后的4～6小时 腹腔注射葡萄糖，按2 g/kg体重标准实施,并测定葡萄糖负荷2小时后的血糖水平，诊断标准为连续2次葡萄糖注射2小时后，血糖≥11.1 mmol/L[6]。52只大鼠采用此方法建模成功。将符合2型糖尿病(T2DM)建模标准的大鼠继续高脂喂养两周。禁食12 小时后，大鼠在空腹条件下断尾取血，并测定空腹胰岛素和空腹血糖值。本实验采用的饲料配方如下:每l00公斤的基础饲料中添加全蛋粉6公斤(由辽宁省沈阳兰生生化制品销售公司提供)、蔗糖23公斤(由辽宁省大连贵州糖业销售公司提供)、炼猪油27公斤(由辽宁省大连利达油脂厂提供)，在将基础饲料和添加剂充分混和后制成饼块，经烤干后备用，干燥储存。

1.2.2 SD大鼠运动模型 将建模成功后的52只大鼠随机分为5组：糖尿病对照组(DMC, n=10)，20分钟运动组(20 M, n=10)、40分钟运动组(40 M, n=10)、60分钟运动组(60 M, n=11)及80分钟运动组(80 M, n=11)。本实验中等运动强度的确定参照Soya等的实验模型，强度为20 m/min[7]。实验中使用电刺激以便控制运动的持续时间。本实验过程中遵守国际动物伦理学的相关规定对动物进行处置。

预染蛋白Marker 购自北京欣兴唐生物科技有限公司。化学发光法(ECL)所用试剂由英国Amersham公司提供。血糖的测定采用快速血糖仪(美国强生公司提供)。放射免疫法测定空腹胰岛素(试剂盒由南京生物工程研究所提供)。动物跑台由北京硕林苑科技有限公司生产(型号为SLY-RTML)。

1.2.3 检测方法

标本采集及制备 采样时间参照前人的实验，在一次性运动的24小时后进行[8]。对大鼠实施麻醉，方法为腹腔内注射麻醉剂(3%的戊巴比妥钠，标准为50 mg/kg)。在处死大鼠后开腹并提取大网膜脂肪组织100 mg，加入预冷的0.5 mL细胞裂解液后在玻璃匀浆器中匀浆、之后将匀浆移入2.0 mLEp试管内。经细胞超声破裂仪将细胞碎裂，方法是300 W、4 s×14 的间隔重复进行6次。最后将碎裂细胞液离心15分钟，条件为12 000 r/min、温度控制在4 ℃。最后取上清液、再进行蛋白浓度测定后置于-70 ℃环境中冷冻、待用。

Resistin 蛋白表达的测定：测定方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。常规方法进行浓缩胶及分离胶的配制。在将各测定组(NC、DMC、20M、40M、60M和80M组)的40μL脂肪组织蛋白样品加入6只Ep管中，再分别将1μL的2%溴酚蓝和8μL10%的SDS加入试管中，经充分混匀后加热到100 ℃(5分钟)，之后将试管离心处理，时间为1分钟(12 000r/min)，完成后提取上清备用。在上样后开始电泳，开始时以较低凝胶电压进行(8 V/cm)，之后逐渐调高(15 V/cm)。最后将SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果进行染色、脱色、成像，并对电泳结果进行扫描和分析。

1.2.4 统计处理：本实验采用SPSS13.0软件包，对实验数据进行统计、分析和处理。组间比较的方法采用双因素方差分析。 α=0.05定为具有显著性差异。

2 实验结果

2.1 建模后，2型糖尿病大鼠的体重、胰岛素、血糖、总胆固醇及甘油三酯等观察指标均发生显著变化，与正常对照组相比，具有显著意义 (Plt;0.01)。详见表1。

表1 2型糖尿病大鼠模型测量指标

2.2 建模后，糖尿病对照组与正常对照组相比，其Resistin/Marker比值显著降低 (Plt;0.01)。经运动干预后，与DMC组相比，各运动时间组Resistin蛋白表达均显著降低(Plt;0.01)。与20M组和40M组相比，60M组下降的幅度最大(Plt;0.01和Plt;0.05)。详见表2。

表2 不同运动时间对Resistin蛋白表达的影响

3 分析与讨论

胰岛素抵抗是2型糖尿病患者所具有的重要特征，更好地治疗该疾病，各国学者均致力于研究胰岛素抵抗形成的生理学机制。Steppan等在研究TZDs药物的作用机制时注意到了一种蛋白质并将其命名为 Resistin。该物质结构特征是由二硫键连接构成的一个三聚体类的大分子(富含半胱氨酸和丝氨酸残基的蛋白)，在生物功能上与胰岛素相互拮抗，并和胰岛素拥有相同的靶器官。研究结果显示小鼠血液 Resistin水平受摄食行为的影响，在禁食48 小时 后其水平明显下降，而在恢复进食后其血液Resistin水平又上升。以高脂饮食诱导的肥胖小鼠血液中 Resistin水平明显升高，同样高水平的Resistin也在遗传性肥胖小鼠血中观察到[9]。研究还发现，经饮食诱导的肥胖小鼠在注射 Resistin 抗体后，可使胰岛素的敏感性及血糖水平得到显著恢复。众多的实验证实Resistin蛋白参与肥胖的产生和糖尿病的发病，在代谢综合征的发生中具有重要的作用[10]。因此，近年来在研究胰岛素抵抗中，Resistin蛋白 已成为一个新的热点[11]。已有的研究证实，Resistin蛋白水平的改变是导致2型糖尿病发病的一个重要前提[12]。因此，人们在寻找预防和治疗2型糖尿病新的、有效的手段时，已将目光聚焦在Resistin蛋白的表达和介导活动中[13]，并已成为新的研究方向。

学者们在运动医学领域里也进行了有益的探索。2006年Kopff B等的研究证实[14]，运动能显著改变血液中Resistin蛋白的水平。之后，众多学者也观察到了相同的结果，即运动可使血清Resistin的水平显著降低[2][3][15]。运动时间是构成运动处方的重要要素，影响运动效果的重要因素，但不同运动时间对Resistin蛋白表达的影响还未见报道。有效的运动时间是实现运动处方治疗目标的基础，为此，世界上有影响的组织和结构都对有效的运动时间进行了推荐。最近(2012)，澳大利亚运动科学(ESSA)推荐了2型糖尿病和糖尿病前人群的运动处方，中等强度(强度在55～89% HR max之间)平均每天的运动时间42分钟(125～210分钟/周)，4天/周(两次运动间歇不超过两天)[16]。美国联邦政府最近推荐的运动频率为:150分钟/周的中等强度或75分钟的大强度运动，或相当于两者结合的等同运动时间， 分配到一周的每一天[17]，每天平均运动的时间不到20分钟。最新(2010)版的2型糖尿病运动指南(ASCM和ADA的联合声明)，基于循证医学，通过荟萃(Meta)分析，对影响运动效果的诸要素，如运动形式、强度、时间及频率进行了全面的总结。推荐的运动时间是中等强度每周150分钟，平均分配至每周的5天中，每次运动持续时间为30分钟[3]。

目前，不同运动持续时间影响T2DM干预效果的观察指标多为血糖、胰岛素及胰岛素抵抗等，而较少探讨运动在提高胰岛素敏感性的过程中Resistin的作用。2010版美国运动医学学会(ASCM)和美国糖尿病协会(ADA)的2型糖尿病运动指南，在Meta分析的基础上，对运动提高胰岛素敏感性的作用进行了系统的总结。细胞摄入血糖主要靠细胞膜上的葡萄糖载体-4(GLUT-4)易位来实现的，当T2DM 产生胰岛素抵抗后，胰岛素-胰岛素受体底物- PI3K/AKT- GLUT-4途径就不能有效激活GLUT-4蛋白，而另一条信号转导通路，即运动-AMPK-GLUT-4途径，就成为细胞摄入血糖的主要通路。运动的作用通过激活这一通路也就更加突显出来了。运动改善糖尿病患者病情的基础就是提高胰岛素的敏感性，在这一过程可能有多种影响因素，但Resistin肯定在其中扮演着重要角色。如能了解运动对其的影响规律，把握对影响其表达的最佳运动持续时间，不仅能加强对运动改善胰岛素敏感性规律的认识，而且运动实践中对制定科学的运动处方也具有较强的意义。

本实验发现，在一次中等强度的运动中，不同运动持续时间均可降低Resistin蛋白的表达。实验观察到，运动持续时间在60分钟内，运动持续时间与Resistin蛋白表达的降低有一定的关联，并且持续60分钟的运动使其表达的效果最佳。但在运动持续时间超过60分钟后，这种关联不明显了，Resistin 表达的降低并没有随着运动时间的延长而继续降低。提示在中等强度运动时，持续60分钟的运动，可能对降低Resistin蛋白的表达效果更好，可能更有利于改善胰岛素的敏感性。联系运动实际，糖尿病患者在实施康复运动处方锻炼时，在推荐的运动持续时间的基础上，再增加运动时间可能更有利于胰岛素敏感性的提高。

4 小结

4.1 不同持续时间的中等强度运动，均可降低2型糖尿病大鼠大网膜脂肪组织内Resistin蛋白的表达。

4.2 持续时间60分钟的中等强度运动，对Resistin蛋白表达降低的幅度大于其他运动持续时间。

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EffectsofdifferentexercisedurationonResistincontentinT2DMrats

LIU Shu-mei1, WANG Yao-guang2,LI Mei-yue1

(1．CollegeofSports,ShandongUniversityofScienceandTechnology,Qingdao266590，Shandong，China；2．CollegeofSports,LiaoningNormalUniversity,Dalian116029,Liaoning，China)

To explore the effects of different duration of exercise on Resistin protein expression in rats with type 2 diabetes is the main objective for this paper.62 SD normal and type 2 diabetes rats were divided into 6 groups: normal control group, diabetes mellitus group, 20 min group, 40 min group, 60 min group and 80 min group. After one-bout exercise with moderate intensity for the exercise groups, the contents of Resistin protein were measured by SDS-PAGE. The contents of Resistin protein in exercise groups decreased (Plt;0.01) respectively compared with the diabetes mellitus group; The contents of Resistin protein in 60 min group decreased significantly compared with 20 min and 40 min group (Plt;0.01 andPlt;0.05). A conclusion can be obtained that the effect of 60 min exercise duration on the expression of Resistin protein is better than that of any other exercise duration.

exercise duration; type 2 diabetes rats; Resistin

2013-10-20

刘淑梅(1962- )，女，辽宁沈阳人，副教授，研究方向运动训练与运动医学。

A

1009-9840(2014)04-0071-04