CIK细胞联合紫杉醇治疗上皮性卵巢癌的初步研究

肖梅 艾月琴 张闯 张燕 高艳荣 胡建华 贾绍昌

卵巢位于腹腔深部，目前缺少有效的诊断方法，首发初诊时70%～80%患者已经是中晚期，在女性生殖器官恶性肿瘤中，其死亡率居于首位[1]。上皮性卵巢癌约占卵巢癌的90%，目前肿瘤细胞减灭术加紫杉醇/铂类联合化疗的治疗方法，可暂时缓解病情，然而复发率却高达85%，晚期患者5年生存率仍然低于30%[2-3]。传统认为，上皮性卵巢癌不具有免疫原性，近来研究表明，上皮卵巢癌患者体内存在免疫应答，更多的临床证据显示，抗肿瘤免疫效应与免疫逃避机制之间的关系预示着更好或者更差的生存率[4]。CIK细胞是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子诱导得来的一群异质细胞，兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤（nature kill，NK）细胞的非组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制性杀瘤的优点，是生物治疗中常用的抗肿瘤效应细胞。本研究旨在探讨上皮性卵巢癌患者中运用自体CIK细胞输注同步紫杉醇化疗的综合治疗方法的安全性和有效性。2011年11月-2013年11月，笔者对17例卵巢癌患者在紫杉醇+卡铂治疗时同步进行了多次自体CIK细胞输注，检测治疗前后患者淋巴细胞亚群和血清细胞因子，观察其临床疗效和不良反应，随访至治疗结束后第3个月。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2011年11月-2013年11月共17例患者入选，均经病理证实为上皮性卵巢癌，其中12例为肿瘤细胞减灭术后仍残存病灶>1 cm，均为术后2周内开始化疗；5例为初诊时无法手术，经2周期化疗后行肿瘤细胞减灭术，仍残存病灶>1 cm；12例治疗开始时有腹水。年龄40～64岁，平均55岁。入选标准：年龄大于18岁的卵巢癌患者；重要脏器功能正常，无自身免疫疾病，卡氏评分在60分以上。排除标准：怀孕或哺乳期妇女，脏器移植者：如肝、心脏和肾等，严重的不可控制的感染，阻碍签署及理解知情同意者。

1.2 主要材料 rhIL-1α为PeproTech产品，CD3单抗为古巴分子免疫学中心 （Cuba CIMAB S.A.）产品。rhIL-2购自北京双鹭药业。rhIFN-γ购自上海凯茂药业，Ficoll分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。无血清培养基GT551为宝日医公司产品，内毒素检测试剂盒购自湛江博康公司。流式抗体试剂为BD公司产品，细胞因子ELISA试剂盒为R&D Systems公司产品。

1.3 方法

1.3.1 CIK体外诱导 所有患者均于化疗开始前1 d采血。采用费森尤斯卡比公司的血细胞分离机COM.TEC采集患者外周单个核细胞约60 mL，常规Ficoll分离外周血单个核细胞，重悬细胞后铺于细胞培养瓶中，于培养瓶内加入含100 ng/mL rhIFN-γ的培养基，放置于37 ℃、5%CO2培养箱中。24 h后，添加终浓度 为 50 ng/mL CD3、50 ng/mL rhIL-1α、500 U/mL rhIL-2。培养过程中及时添加含500 U/mL rhIL-2的新鲜培养基。至培养的第10天、第12天、第14天收获成熟CIK，通过形态学、特异性表面标记等进行鉴定，真菌、细菌、内毒素检测合格后方可进行CIK回输，同时终产品留样备查。按《中华人民共和国药典》2010版第三部规定的方法进行内毒素和无菌的检测。以上操作均在符合GMP条件的实验室进行。

1.3.2 方法 自体采血，次日开始化疗，化学治疗结束后第8天开始CIK回输，每次间隔1天，共3次，每次（1～2）×109个CIK细胞。CIK回输结束2周后进行第2次化学治疗，同样再次注射CIK，最少治疗2个周期。化疗方案为TC方案，当天给予紫杉醇135 mg/m2，>3 h静脉滴注，次日给予卡铂。卡铂剂量根据患者肾功能情况确定，卡铂（mg）=AUC×（GFR+25），GFR为患者的肾小球滤过率，单位为mL/min，AUC值取6。

1.3.3 临床观察 疗程治疗开始前l周及疗程治疗结束后2周内进行临床评价，包括全面的病史采集，体格检查及血常规、肝肾功能的检查，严格观察不良反应的发生情况。在每次细胞输注后30 min及24 h，按《抗肿瘤药物急性与亚急性毒性反应分度级标准》观察患者是否出现不良反应。主要毒性反应为骨髓抑制、脱发、神经毒性和胃肠道反应。细胞免疫前2 d和细胞免疫结束后1周，用流式细胞仪检测外周血CD3+、CD4+、CD8+等T淋巴细胞亚群和NK细胞的比率以及检测血清Th1型细胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α）的水平。按实体瘤治疗疗效评价标准RECIST标准进行评价[4]。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T细胞亚群 治疗后患者外周血T细胞亚群分析显示，CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例较治疗前明显升高（P<0.05），CD3+CD4+比例和CD4+CD25+Treg细胞比例下降，见表1。

表1 治疗前后T淋巴细胞亚群变化（±s） %

表1 治疗前后T淋巴细胞亚群变化（±s） %

*与治疗前比较，P<0.05

时间 CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3+CD56+ CD4+CD25+治疗前（n=17） 57.23±13.20 31.53±13.03 35.16±15.12 12.35±5.28 2.48±1.02治疗后（n=17） 63.69±14.52* 29.64±14.19 40.64±10.56* 16.17±5.18* 1.83±0.81

2.2 细胞因子水平的变化 患者治疗前后Th1型细胞因子分析显示，与治疗前比较，治疗后患者血清IL-2、IFN-γ、TNF-α水平显著提高（P<0.05），其中以IFN-γ水平治疗后升高最为显著，见表2。

表2 治疗前后细胞因子变化（±s） pg/mL

表2 治疗前后细胞因子变化（±s） pg/mL

*与治疗前比较，P<0.05；△与治疗前比较，P<0.01

时间 IL-2 IFN-γ TNF-α治疗前 28.4±18.9 17.95±9.30 29.6±12.3治疗后 47.5±20.1* 48.2±21.2△ 43.7±14.8*平均升高倍数 1.67±0.90 2.68±2.30 1.85±0.80

2.3 近期疗效 17例可评价病灶患者中，2例完全缓解（CR），13例部分缓解（PR），2例稳定（SD）。有效率（CR+PR）为88%。12例患者腹水缓解明显。由于部分患者继续接受化疗影响，患者的生活质量改善情况无法评价。卡氏评分提高的患者有10例，其中尤以纳差、食欲和睡眠改善最为明显；体重增加有4例。2.4 毒性反应 未出现Ⅳ度粒细胞、血小板减少及Ⅳ度贫血。所有患者中，经预防性应用止吐药物，16例患者发生轻微胃肠道反应；15例患者发生脱发；10例患者有肌肉酸痛手脚麻木畏冷等。CIK细胞输注后，2例患者24 h内出现发热，体温均低于39 ℃，未给予特殊处理，在6～24 h内恢复正常，未出现恶心、呕吐、头痛等症状，未发现Ⅲ度及以上不良反应，表明细胞免疫治疗是安全的，无明显毒副作用。

3 讨论

卵巢癌有强大的免疫逃避的能力，其肿瘤细胞与宿主免疫细胞网络之间搭建了一个免疫抑制的肿瘤微环境。在肿瘤微环境中，免疫抑制作用增强，如调节性T细胞的水平，细胞因子如白介素-10（interleukin-10，IL-10）、 白 介 素 -6（interleukin-6，IL-6）、 转 化 生 长 因 子 -β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平上调，从而促进肿瘤的生长，保护肿瘤细胞从治疗中逃逸[5-7]。卵巢癌患者多数一线治疗后缓解期短暂，85%患者在化疗后复发，而且复发的中位时间不到2年，晚期上皮性卵巢癌的治疗迫切需要寻找更为有效的治疗手段。

细胞免疫治疗以其独特的优势越来越广泛地应用于肿瘤的临床治疗。由于化疗药物的骨髓抑制性，传统观念一般认为化疗和细胞免疫治疗不相容，近年来越来越多研究表明，在循证、规范的综合治疗原则下，这两者不仅能相容，而且能产生协同抗肿瘤效应。在实体瘤治疗中，虽然化疗常常引起肿瘤患者中性粒细胞减少症（neutropenia），但很少发生淋巴细胞减少症（lymphopenia），这表明化疗不削弱免疫效应细胞功能[8]。化疗对免疫系统有一些有益的影响，如化疗能对髓系来源抑制细胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC）以及/或者调节性T细胞（Treg）产生影响；增加肿瘤细胞对凋亡的敏感性或导致肿瘤细胞免疫原性增加，以及调节免疫应答反应等方式增强免疫治疗效果[9-10]；同时，免疫治疗能够逆转肿瘤细胞的化疗耐药性，从而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性并降低化疗的毒性作用等。细胞免疫治疗与化疗的联合使用可作为肿瘤治疗中一种合理方案[11]。

紫杉醇加铂类的方案是治疗卵巢癌的主要一线化疗药物，主要是通过将细胞阻滞于G2/M期，使癌细胞复制受阻死亡。紫杉醇主要的毒性反应有：过敏、骨髓抑制、神经毒性、胃肠道反应和肝脏毒性等，毒性反应的大小具有剂量相关性。自体CIK细胞输注是将外周血中的单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养后获得的一群异质性细胞，其中的主要效应细胞是CD3+CD8+T细胞和CD3+CD56+NK样T细胞。徐梅等[12]体外实验发现CIK细胞能诱导卵巢癌SKVO-3细胞的调亡，联合CIK细胞能明显增强紫杉醇对SKVO-3细胞的杀伤作用。Liu等[13]研究了上皮性卵巢癌手术及一线化疗后CIK细胞的维持治疗的疗效，与对照组相比，细胞治疗延长了患者的无进展生存期，但总生存率未有明显获益。

在国内外研究基础上，笔者采用TC方案化疗同步输注自体CIK细胞的方案治疗晚期上皮性卵巢癌患者，最少治疗2个周期，17例患者共治疗52个周期，输注156人/次自体CIK细胞，每次细胞数量>109个。可评价病灶的患者中，完全缓解率为11%，部分缓解率为76%，5例有腹水患者在治疗后均腹水缓解。17例患者化疗后的毒性反应有不同程度的骨髓抑制、脱发、神经毒性和胃肠道反应等。CIK输注未发生严重不良反应，80%患者主诉CIK输注后，胃肠道反应减轻，精神状态转好。杜鸿昱等[14]通过对卵巢癌患者TC方案化疗前后T淋巴细胞亚群变化分析发现，化疗结束2周后CD3+、CD3+CD4+细胞比例升高，CD3+CD8+细胞比例下调；杨海青等[15]报道卵巢癌患者外周血CD4+CD25+Treg细胞比例明显偏高。有研究报道，单药紫杉醇联合CIK维持化疗治疗晚期卵巢癌患者后，CD3+、CD4+和NK细胞都有升高趋势，CD3+CD8+稍有下降[16]。笔者对本组患者治疗前后T淋巴细胞亚群分析发现，治疗后外周血CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例较治疗前明显升高（P<0.05），同时CD3+CD4+比例和CD4+CD25+Treg细胞比例下降。

Th1/Th2在肿瘤发生、发展及复发过程中起着十分重要的作用，肿瘤患者的免疫抑制导致Th1反应向Th2的漂移（Th1/Th2漂移），呈Th2类细胞因子强势表达状态[17]。最近的一项研究表明，Th1细胞分泌的IFN-γ和TNF-α通过CDKN2A–Rb信号通路对肿瘤细胞造成持久的细胞衰老和生长停滞，说明细胞因子的检测有一定的意义[18]。卵巢癌患者体内存在免疫应答，一些临床证据表明，抗肿瘤免疫效应与免疫逃避机制之间的关系预示着更好或者更差的生存率[4]。因此，在对上皮性卵巢癌的综合治疗中化疗方案同步输注CIK细胞，增加患者应急免疫调节以抵消免疫微环境的免疫抑制作用，是有积极意义的。本研究中患者卵巢癌患者经治疗后，外周血IFN-γ的水平和其它Th1类细胞因子IL-2、TNF-α的水平也明显升高。说明CIK治疗能部分纠正患者的免疫抑制状态，改善患者预后。

受患者样本量和研究时间限制，本组患者未考察无进展生存期和总生存率，在治疗中笔者发现，TC方案化疗同步输注自体CIK细胞的晚期卵巢癌患者的肿瘤综合治疗方法，能部分纠正患者的免疫抑制，提高患者Th1类细胞因子水平，有腹水的患者腹水缓解明显，毒性反应温和，耐受良好，治疗顺应性好，具有良好的临床应用前景。

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