超声辅助提取银杏酸工艺优化试验

刘军海，耿敬章

(1.陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西 汉中 723001；2.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001)

超声辅助提取银杏酸工艺优化试验

刘军海1，耿敬章2

(1.陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西 汉中 723001；2.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001)

以银杏外种皮为原料，在单因素试验基础上，采用二次回归正交试验优化超声辅助提取银杏皮中银杏酸的工艺条件。结果表明，超声辅助提取银杏皮中银杏酸的最优工艺条件为：超声波频率25 kHz、料液比1∶26 g·mL-1、提取时间1.83 h、提取温度56 ℃，银杏酸提取率为1.91%。

超声波辅助；二次回归正交试验；银杏酸；提取工艺

银杏(GinkgobilobaL.)为银杏科(Ginkoaceae)银杏属植物，银杏中主要的活性物质是银杏黄酮类、银杏内酯和银杏酸。目前已知的银杏酸主要包括白果酸、氢化白果酸、氢化白果亚酸和白果新酸[1-3]。据报道，银杏酸具有潜在的致敏性、致突变作用和强烈的细胞毒性，可引起严重的过敏反应、基因突变、神经损伤，痉挛和神经麻痹等不良反应[4-5]，对烟曲霉、赭曲霉、串珠镰刀菌、申珠镰刀菌等多种真菌和细菌有较强的抑制作用[6]。银杏外种皮是银杏果仁的皮层，其银杏酸含量比银杏叶、银杏果肉高。超声辅助提取具有多种优点，近年来在天然产物深加工领域得到广泛应用。本文采用二次回归正交法对银杏外种皮中银杏酸提取工艺进行优化，以期为银杏资源的综合开发利用提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 原料、试剂

原料银杏购于当地中药材批发市场，人工取皮，烘干粉碎后过60目筛，置电热恒温鼓风干燥箱中备用；银杏酸标准品，纯度>99%，上海同田生物技术股份有限公司；甲醇、环己烷、石油醚、乙酸乙酯、冰醋酸等试剂均为分析纯。

1.2 试验设备

JBT/C-YCL400/3P(D) 超声波药用提取机(济宁金百特电子有限公司)；Cary50型紫外可见分光光度计(美国瓦里安公司)；Agilent 1260高效液相色谱法仪(赛谱锐思(北京)科技有限公司)；ZF-7型三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；FW117中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信试验仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；GR-200电子天平(日本AND)等。

1.3 标准曲线的绘制

精密称取一定量的标准品，用无水甲醇溶解，定容至100 mL，即配成质量浓度为40 mg·L-1的贮备液。分别量取贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。在分光光度计242 nm处测定其吸光度值，得到242 nm处标准曲线方程式为：y=0.02275x+0.00135(R=0.997)。

1.4 银杏酸的提取流程

称取银杏外种皮粉末1 g→加入正已烷→超声辅助提取银杏酸→提取液过滤→取滤液1.0 mL→挥干溶剂→甲醇溶解→242 nm处测定吸光度值→计算提取率。

1.5 原料中银杏酸含量的测定

称取外种皮粉末2 g，加入150 mL正已烷索氏回流提取12 h，提取液用正已烷定容至100 mL。量取提取液10 mL于80 ℃水浴中浓缩至干，用75%甲醇5 mL溶解后，采用微量注射器吸取1 mL在薄层板上进行条状点样，展开剂(石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸=17∶1∶2)展开后，在三用紫外仪(254 nm)下，选取蓝色荧光部分物质进行甲醇洗脱，定容至10 mL，微孔滤膜过滤后用高效液相色谱法(HPLC)测定银杏酸得率。色谱条件为C18色谱柱，流动相为甲醇-2%冰醋酸水溶液(90∶10 V/V)；流速1.0 mL·min-1；检测波长310 nm；柱温45 ℃；进样量20 μL，外标法计算，以确定银杏酸得率[7-8]。

1.6 试验设计

1.6.1 单因素试验 单因素试验主要研究不同超声频率(10、20、30、40、50、60 kHz)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g·mL-1)、提取时间(1、1.5、2、2.5、3、3.5 h)、提取温度(30、40、50、60、70、80 ℃)4个因素对银杏酸提取效果的影响。

1.6.2 二次回归正交试验 在单因素试验基础上，利用二次回归正交试验进行提取工艺优化。试验设计因素水平见表1。

2 试验结果与分析

2.1 各因素对提取效果的影响

2.1.1 超声波频率对银杏酸提取率的影响 在提取温度60 ℃、料液比1∶30 g·mL-1、提取时间2 h条件下，不同超声波频率对银杏酸提取率的影响见表2。由表2可知，在30 kHz超声条件下，银杏酸的提取效果较好。这是由于超声波产生的强烈空化效应，高加速度，粉碎和搅拌作用，增加了溶剂穿透力，加速了提取物的溶解，因此提取率较高。在频率为30 kHz时，银杏外种皮内的纤维细胞结构已基本破坏完全，再增加频率，银杏酸提取率变化不大。

表1 二次回归正交试验因素及水平表

表2 超声波频率对银杏酸提取率的影响

2.1.2 料液比对银杏酸提取率的影响 在超声波频率30 kHz、提取温度60 ℃、提取时间2 h条件下，不同料液比对银杏酸提取率的影响见表3。由表3可知，随着料液比的提高，提取率相应增加，在料液比达到1∶25 g·mL-1时提取率基本不变，故料液比选1∶25 g·mL-1。

2.1.3 提取时间对银杏酸提取率的影响 在超声波频率30 kHz、料液比1∶25 g·mL-1、提取温度60 ℃条件下，不同提取时间对银杏酸提取率的影响见表4。由表4可知，随着提取时间的增加，提取率相应增加，3 h以后基本趋于不变；但时间过长，粗提液杂质较多，所以3 h提取效果较好。

表3 不同料液比对银杏酸提取效果的影响

2.1.4 提取温度对银杏酸提取率的影响 在超声波频率30 kHz、提取时间3 h、料液比1∶25 g·mL-1条件下，不同提取温度对银杏酸提取率的影响见表5。由表5可知，随着温度的升高，提取率相应增加；但提取温度过高，提取溶剂挥发，且银杏酸结构会有一定程度破坏，因此选70 ℃为提取较适宜温度。

2.2 二次回归正交试验结果与分析

2.2.1 试验结果 以提取率(Y)为响应值，按表1进行试验，试验方案及结果见表6。

2.2.2 试验结果方差分析 采用SAS 8.01软件对表6数据进行四元非线性回归分析(多项式回归)[6]，试验结果的方差分析见表7、回归方程的方差分析见表8，预测分析见表9。

表4 提取时间对银杏酸提取效果的影响

表5 提取温度对银杏酸提取效果的影响

表6 响应面试验方案及结果

表7试验结果的方差分析表明，回归方程的模型F值为31.96129，Pr=0.0001<0.01，说明这种试验方法是可靠的。交互项中X1×X2达到非常显著统计程度(Pr<0.01)，X1×X3和X2×X3达到显著统计程度(Pr<0.05)，说明超声辅助提取银杏酸时，各因素交互作用对提取率有较大影响，即X1(超声波频率)与X2(料液比)的交互作用非常显著，X1(超声波频率)与X3(提取时间)、X2(料液比)与X3(提取时间) 的交互作用显著。因此，在实际操作过程中，当操作条件发生改变时，应根据因素间的交互作用适当调节其他因素。如当超声波频率发生改变时，可调节料液比和提取时间，以保证有较高的提取率。

由表8可知，一次项、二次项和交互项均已达到非常显著统计水平，方程达到非常显著的统计程度(P=0.0001<0.01)；相关系数R2=0.9552，表明自变量(提取率)和因变量(各影响因素)之间有极显著的回归关系，说明模型可用于超声波辅助提取银杏酸提取率的预测，可为实际应用提供参考。

由表9可知，超声波频率(X1)和提取时间(X3)对银杏酸提取率为负效应，料液比(X2)和提取温度(X4)为正效应，各因素的二次项均为负效应。一次项的X3和X4，交互项的X1×X2、X1×X3和X2×X3，以及各二次项最具预测力，其余的变量则无显著预测力。结合表7分析结果，进一步说明在银杏酸提取过程中，各因素的交互作用对试验结果有较大的影响[9]。

表7 试验结果的方差分析

表8 回归方程的方差分析

表9 试验结果的预测分析

决定系数R2=93.41%，即剔除变量后，回归方程自变量的变化可以解释93.41%的因变量变化，这主要是银杏酸提取过程受较多因素影响，方程未计入全部变量，另外也由于试验误差，因此决定系数减小，但剔除变量后的方程达到0.01显著统计程度，结果较为理想。

对此方程分别对X1、X2、X3、X4求偏导，并等于零。可求得X1=-0.052948、X2=0.0361642、X3=0.137973、X4=-0.345157，最大值1.911。由此可求得最佳工艺条件，并考虑到实际操作的便利性，则超声波频率25 kHz、料液比1∶26 g·mL-1、提取时间1.83 h、提取温度56 ℃，在此条件下进行验证试验，结果银杏酸提取率为1.91%。经HPLC测定，银杏酸得率为94.6%。

3 结论

1) 二次回归正交试验结果表明，采用超声辅助提取银杏皮中银杏酸的最佳工艺条件为：超声波频率25 kHz、料液比1∶26 g·mL-1、提取时间1.83 h、提取温度56 ℃。在此条件下，银杏酸提取率为1.91%。

2) 在银杏酸提取过程中，各因素的交互作用对试验结果有较大的影响。当操作条件发生改变时，应根据因素间的交互作用适当调节其他因素，以保证有较高的提取率。试验结果对于银杏资源的开发利用具有一定的指导意义。

[1]耿敬章.银杏中营养成分和功能因子的研究进展[J].氨基酸和生物资源，2011，33(1)：63-66.

[2]赵东亚，唐进根，陈利红，等.银杏外种皮提取银杏酸工艺的优化试验[J].林业科技开发，2012，26(5)：79-82.

[3]潘苏华，董李娜.不容忽视的毒性物质——银杏酸[J].中国现代药物应用，2007，1(12)：107-108.

[4]Angela I.Reaa，Jennifer M.Schmidta，William N.Setzer，et al.Cytotoxic activity of Ozoroa insignis from Zimbabwe[J].Fitoterapia，2003，74(7)：732-735.

[5]Rikako Suzuki，Hiroyuki Kohnoa，Shigeyuki Sugie，et al.Preventive effects of extract of leaves of ginkgo (Ginkgo biloba) and its component bilobalide on azoxymethane-induced colonic aberrant crypt foci in rats[J].Cancer Letters，2004，210(2)：159-169.

[6]姜晓明，赵献军.银杏外种皮提取物对霉菌的抑制作用[J].西北农业学报，2007，16(6)：30-33.

[7]罗曼，鲍家科，宋晓宁，等.固相萃取-HPLC法测定白果中总银杏酸的含量[J].中国药房，2011(27)：2546-2548.

[8]秦俊哲，郭云霞，席章娇.响应面法优化超声波提取银杏茶中银杏酸工艺[J].中国酿造，2011(10)：71-74.

[9]巨敏，杨鹏，朱沛沛，等.二次回归正交优化枸杞中总黄酮提取工艺的研究[J].中国酿造，2011，235(10)：94-96.

Technical Optimization Experiment of Ultrasonic-Assisted Extraction of Ginkgoic Acid

LIU Jun-hai1，GENG Jing-zhang2

(1.CollegeofChemistry&EngineeringScience，ShanxiUniversityofTechnology，Hanzhong723001，Shanxi，China；2.CollegeofBiologicalScience&Environment，ShanxiUniversityofTechnology，Hanzhong723001，Shanxi，China)

Ginkgoic acid was extracted through ultrasonic aids to use seed coat of ginkgo as matierial.The process conditions were optimazed by quadratic regression orthogonal test method based on single factor experiment.The results showed that the optimum process conditions were as follows：ultrasonic frequency 25 kHz，ratio of material to liquid 1∶26 g·mL-1，extracting time 1.83 h，extraction temperature 56 ℃.The ginkgoic acid extraction efficiency could reach 1.91%.

ultrasonic assistance；quadratic regression orthogonal experiment；ginkgolic acid；extracting technique

10.13428/j.cnki.fjlk.2014.01.020

2013-04-02；

2013-05-06

陕西省教育厅2012年科学研究项目计划(12JK0602)

刘军海(1972—)，男，陕西渭南人，陕西理工学院讲师，硕士，从事天然产物改性与应用化学品方面的研究。E-mail：iamliujunhai@126.com。

S792.95；S789.7

A

1002-7351(2014)01-0092-05