五种芽孢杆菌对小菜蛾的拒食作用及对Bt杀虫增效作用的研究

张贵森,刘慧芹,2，张宝俊， 韩巨才，刘慧平

(1.山西农业大学 农学院, 山西 太谷 030801; 2.天津农学院 园艺系, 天津 300384)

五种芽孢杆菌对小菜蛾的拒食作用及对Bt杀虫增效作用的研究

张贵森1,刘慧芹1,2，张宝俊1， 韩巨才1，刘慧平1

(1.山西农业大学 农学院, 山西 太谷 030801; 2.天津农学院 园艺系, 天津 300384)

采用浸叶法测定了芽孢杆菌LP-5、LB-2、YC-8、F-3、LP-1对小菜蛾的拒食作用，比较了5种菌株对小菜蛾的非选择性和选择性拒食作用。结果表明LP-5在处理48 h后的非选择性拒食率和选择性拒食率分别高达91.30%和90.76%，具有较明显的拒食作用。同时，不同浓度的LP-5发酵液对苏云金芽孢杆菌(Bt)制剂的杀虫活性有不同程度的影响，均对Bt具有增效作用，其中原液与Bt制剂的混合液的增效达44.78%。

小菜蛾；芽孢杆菌；拒食作用；Bt；增效作用

近年来，国内外广泛利用有益微生物及其代谢产物来抑制病虫害的生存和活动，使这一防治策略发展迅速，其中拮抗细菌在植物病虫害防治中起到非常重要的作用，无论是自然发生的生物防治现象还是人们用于生物防治的生物类型中，细菌的作用是非常明显的[1]。利用细菌杀虫已经有100多年的历史，目前筛选的杀虫细菌有100多种。其中开发成产品的主要有4种：苏云金芽孢杆菌(Bt)、球形芽孢杆菌(Bs)、日本金龟子芽孢杆菌和缓死芽孢杆菌。在这4种细菌中又以前两种细菌为主[2]。芽孢杆菌是一群好氧或兼性厌氧、产芽孢的G+杆菌的总称，其生理特征丰富多样，分布极其广泛，极易分离培养，是土壤和植物体表、根际的重要微生物种群[3]。它还能产生耐热抗逆的芽孢，这有利于商品化生产，其生产成本低，种类繁多是一种较理想的生防微生物[4]。小菜蛾(PlutellaxylostellaL.) 属鳞翅目，菜蛾科。全国各地均有发生，危害甘蓝、花椰菜、白菜、油菜、萝卜等十字花科蔬菜[5,6], 但以南方各省广大蔬菜产区和西部油菜产区发生较为严重[7]。但是近年来，随着苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)的大量使用，小菜蛾对其产生抗药性。冯夏[8]报道广东深圳、东莞地区等供港菜区小菜蛾对Bt的抗性为17.97～30.65倍。李建洪等[5]对深圳、东莞和广州菜区的田间小菜蛾种群检测结果表明，对上海、深圳、东莞的田间小菜蛾种群监测结果表明, 抗性分别达611倍、819倍和615倍。为了提高Bt对小菜蛾的毒杀作用，国内外许多学者一直在研究提高Bt杀虫效果的方法[9]。本实验对拮抗芽孢杆菌的抗虫作用进行了研究，测定了5种内生细菌对小菜蛾的拒食作用，选出拒食率相对较高的菌株。同时，将其与Bt混用来初步研究它们对Bt的增效活性。由于植物内生细菌能够显著影响Bt的杀虫活性，这对减少环境污染、降低小菜蛾的抗药性具有指导意义，以期能对防治小菜蛾为害提供理论依据和有效方案。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

植物内生细菌LP-5、LB-2、YC-8、F-3、LP-1由山西农业大学农药实验室分离纯化保存。

1.1.2 试验对象

小菜蛾(PlutellaxylostellaL.)，在温室25℃±1℃，相对湿度70%±10%，L/D=14/10条件下人工饲养。幼虫饲喂甘蓝，成虫饲喂5%蜂蜜水，取2～3龄的幼虫测试。

1.2 研究方法

1.2.1 发酵液的制备

将5个菌株分别接种于BPY培养液中(蛋白胨 1%、牛肉浸膏 0.5%、酵母粉 0.5%、葡萄糖 0.5%、NaCl 0.5%，pH为7.0)，28℃、150 r·min-1振荡培养72 h后，10 000 r·min-1离心20 min去除菌体获得发酵液。

1.2.2 非选择性拒食作用测定

以浸渍叶碟饲喂法[10]测定。用清水将新鲜的甘蓝叶片洗净晾干，用圆形打孔器(直径=1.5 cm)打成叶碟，分别放入到5个菌株的发酵液处理30 s，以清水为对照，取出晾干后转入垫有保湿滤纸的培养皿中。每个培养皿中放4枚处理叶蝶，接入1头已饥饿6 h的小菜蛾3龄幼虫。于24 h后用坐标纸测定取食叶面积，更换新鲜处理叶蝶，48 h后再次调查取食叶面积。试验重复3次，并按如下公式计算拒食率，用Duncan氏方法比较各处理间的差异。

非选择性拒食率/%= (对照取食叶面积-处理取食叶面积)/对照取食面积×100

1.2.3 选择性拒食作用测定

在培养皿中放入对照和处理叶蝶各2枚，然后接入饥饿6 h的小菜蛾3龄幼虫1头，其余同非选择性拒食作用测定。试验重复3次，并按公式计算拒食率，用Duncan氏方法比较各处理间的差异。

选择性拒食率/%= (对照取食叶面积-处理取食叶面积)/(对照取食叶面积+处理取食叶面)×100

1.2.4 增效作用测定

称取0.1 g Bt粉剂，分别稀释成250，500，1000倍液，将甘蓝叶片洗净晾干，浸渍在上述3种稀释液30 s，取出晾干，转入垫有保湿滤纸的培养皿中，每个培养皿中接入10头小菜蛾3龄幼虫。于24 h后检查结果，调查死亡的幼虫个数。以清水为对照。3次重复。选择最适合Bt的浓度，进行增效试验测定。

选用拒食率高的菌株发酵液用无菌水分别稀释5、10、20倍，加入1000 mg·L-1的Bt制剂。测定不同浓度混合液对小菜蛾的毒杀作用。方法如上。并按公式计算校正死亡率：

校正死亡率/%=(对照组生存率-处理组生存率)/对照组生存率×100

试验和饲养虫的温度均为25℃, 试验数据Microsoft Excel 2003和SASV8.01软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 非选择性拒食作用测定

测定结果见表1，不同的植物内生细菌对小菜蛾都有不同程度的拒食作用。非选择性拒食作用随着时间的增加而降低。在非选择性拒食中，LP-5 、F-3、YC-8、LP-1的作用较明显，其中以LP-5的作用最强，处理24 h后的拒食率高达97.01%，与F-3、LB-2差异不显著，与其它两种菌株差异显著。而LP-5处理48 h后的拒食率仍高达91.30%，与其它四种菌株差异显著，由此可见LP-5的非选择性拒食作用效果最好。

2.2 选择性拒食作用测定

测定结果见表1，选择性拒食中也是LP-5的拒食率最高，处理48 h后的拒食率高达90.76%。而其他的选择性拒食作用不明显。由此可以看出，LP-5对小菜蛾有强烈的拒食作用。综合考虑菌株的毒性及对小菜蛾的生物活性，认为LP-5可以用于增效试验的测定。

表1 不同菌株对小菜蛾的拒食作用

注：表中的小写字母和大写字母分别表示新复极差检验中0.05和0.01的差异显著性。

Note： The data in the same columns following by the same letters are significantly different by Duncan's test (P=0.05) or (P=0.01)

2.3 增效作用测定

2.3.1 不同稀释液的Bt对小菜蛾的毒杀作用

测定结果见表2，生物杀虫剂Bt的不同稀释液对小菜蛾都有不同程度的毒杀作用，由于Bt的250、500倍稀释液在48 h内的校正死亡率分别为87.5%和75.0%，毒杀作用较明显，而在1000倍的稀释液中，48 h内的校正死亡率为25.0%，毒杀作用不明显。对1000倍的Bt稀释液作增效试验。

表2 不同浓度的Bt对小菜蛾的毒杀作用

2.3.2 LP-5不同稀释液对Bt杀虫效果的影响

测定结果见表3，LP-5不同稀释液与1000倍的Bt稀释液混合，其对小菜蛾的毒杀作用有不同程度的增加。毒杀作用随着LP-5稀释倍数的升高而有所减小，其中原液与Bt的混合液比Bt单剂增效了44.78%，增效程度较明显；20倍的LP-5稀释液的增效程度仅为3.41%，由此可见，植物内生细菌LP-5对1000倍的Bt稀释液具有增效作用。

表3 LP-5不同浓度的LP-5发酵液对Bt杀虫效果的影响

3 讨论与结论

Bt克服了传统化学农药污染环境、对人畜不安全等缺点，具有对昆虫天敌、人畜安全，不污染环境，昆虫不容易产生抗性等特点，因此被广泛应用于农、林、医、仓储等领域的害虫生物防治，是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的90%～95%[11]。但是Bt还具有菌种容易退化、基因产物表达水平受细菌自身调节系统及毒素基因拷贝数的限制、杀虫范围窄、有效成分易分解等缺点。然而迄今为止，已经发现许多昆虫能够对Bt产生抗性[5,8,12]。

细菌源农药本身对害虫具有一定的毒杀作用，对环境无污染，在自然条件下易降解，对人畜无毒，使用安全，符合可持续农业发展的要求[13]。为了验证植物内生菌LP-5具有细菌源农药的特征，本实验发现LP-5对小菜蛾具有拒食作用，同时对Bt防治小菜蛾具有一定的增效作用，尤其是原液的增效程度达44.78%。因此LP-5正是具有这种特性的潜在生防菌，特别是与其它农药混用，可提高农药的防治效果，增加农业的经济收益，这在生产上具有较好的应用前景。

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[7]冯夏,李振宇,吴青君,等.小菜蛾抗性治理及可持续防控技术研究与示范——公益性行业(农业)科研专项“小菜蛾可持续防控技术与示范”进展[J].应用昆虫学报,2011,48 (2):247-253.

[8]冯夏,陈焕瑜,帅应恒,等.广东小菜蛾对苏芸金杆菌的抗性研究[J].昆虫学报,1996,39(3):238-240.

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TheAntifeedingEffectsofFiveStrainsofBacillusonPlutellaxylostellaandSynergisticEffectsonBt

Zhang Guisen1,Liu Huiqin1,2, Zhang Baojun1, Han Jucai1, Liu Huiping1

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China; 2.DepartmentofHorticulture,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China)

The antifeeding effects ofBacillusLP-5, LB-2, YC-8, F-3, LP-1 onPlutellaxylostellawere tested with leaf dipping method. Non-selective and selective effects of five strains ofBacillusonPlutellaxylostellawere compared. The results showed that non-selective and selective antifeeding rates by LP-5 reached 91.30% and 90.76%, respectively, showing significant effects. Meanwhile, fermentation broth of LP-5 with different concentrations had different effects on the activity ofBacillusthuringiensis(Bt), though all showed synergistic effect. Moreover, synergistic effect of the crude fermentation broth with Bt reached 44.78%.

Plutellaxylostella;Bacillus; Antifeeding; Bt; Synergy

2014-04-29

2014-05-27

张贵森(1985-)，男(汉)，山西朔州人，助教，研究方向：农药制剂加工应用。

韩巨才，教授，博士生导师，Tel：0354-6288679；E-mail: sxndhjc@163.com

山西省科技基础条件平台建设项目(2014091003-0102)；山西省科技攻关项目( 20110311013-1)；山西省财政支持农业科技成果转化资金(SCZZNCGZH201304)

S476

A

1671-8151(2014)05-0407-04

(编辑：武英耀)