Bt棉功能叶氮代谢对Bt蛋白表达及氮肥调节的响应

李晓荣，张美俊，杨武德，冯美臣，武志明

(山西农业大学 农学院 山西 太谷 030801)

Bt棉功能叶氮代谢对Bt蛋白表达及氮肥调节的响应

李晓荣，张美俊，杨武德，冯美臣，武志明

(山西农业大学 农学院 山西 太谷 030801)

为评价外源Bt基因插入以及氮肥对Bt棉功能叶Bt蛋白表达及氮代谢的影响，对Bt棉功能叶Bt蛋白含量，硝酸还原酶、谷丙转氨酶和蛋白酶活性，可溶性蛋白质和全氮含量等指标进行了测定。结果表明：Bt棉功能叶Bt蛋白含量在蕾期最高，此后，随生育进程呈显著下降。与常规棉相比，Bt棉功能叶硝酸还原酶活性提高，在前中期谷丙转氨酶活性显著提高且有利于可溶性蛋白质的合成，前期全氮含量显著增加，对蛋白酶活性没有明显影响。Bt棉功能叶Bt蛋白含量与硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质和全氮含量呈显著正相关，表明Bt棉前期增强的氮代谢促进了Bt蛋白的表达。施氮肥明显提高Bt棉中后期功能叶硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质含量和Bt蛋白的表达。基施和初花期各50%的效应显著大于全部基施，而在基施氮肥基础上，初花期增施50%的氮肥效应最明显。与常规棉比较，施氮肥更有利于Bt棉中后期功能叶硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质含量提高。

Bt棉；Bt蛋白；氮代谢；氮肥

国际农业生物技术应用服务组织ISAAA报道，2011年全球转基因棉花种植面积达2470万hm2，占全球棉花总种植面积的68.6%，其中Bt抗虫棉是应用和种植的主要贡献品种。我国自1997年Bt棉投入生产种植以来，其种植面积迅速扩增，2011年我国Bt棉种植面积达390万hm2，占棉花总种植面积的71.5%[1]。对于转基因作物，由于体细胞无性系变异，外源基因插入受体基因组区位的随机性和不确定性以及基因间的互作，可导致活性基因的修饰或沉默以及沉默基因的激活，进而可能导致新的代谢物形成或改变原有代谢物的水平(速率)[2～4]。

田间试验表明，与其受体品种相比，Bt棉新棉33前期出苗慢、幼苗素质差[5]。Bt棉GK-12结铃性增强，单株果枝数、单株果节数、棉铃长度、棉铃体积、棉铃经济系数、铃重均下降，棉铃外形由圆锥形突变为卵圆形，铃柄长度大幅度增加[6]。田晓莉等[7]发现，Bt棉中棉30的单株叶面积、叶面积系数和侧根数量较轮回亲本中棉16大幅度降低，但结铃性强且库活性高，因此源库关系失调，容易早衰。刘微等[8]以克螟稻1号及其对照亲本秀水11为材料，分析了Bt基因对水稻光合特性及光合产物积累的影响，认为外源Bt基因的导入对温室种植条件下水稻叶片光合特性具有短暂影响，但这种影响不具有持续性。克螟稻1号大多数碳代谢指标的显著变化主要是由无性系变异引起的[9]。Bt蛋白的表达是氮素合成Bt蛋白的氮代谢过程，作为氮代谢过程的一部分，外源蛋白表达如何引发植株自身在氮代谢方面产生非预期效应还不确定[4]。氮素是Bt作物Bt蛋白的主要成分之一[10]，因此，氮素的供应同样会影响Bt蛋白表达。Alinia等[11]研究认为，随施氮量的增加，Bt水稻Bt蛋白表达量将随之增加。Bruns和Abel[12]研究也表明，增加氮肥供应量，相应地增加了Bt玉米叶片中Bt蛋白表达量。因此，从与Bt基因表达Bt蛋白密切相关的氮代谢着手，研究Bt基因插入后Bt棉氮代谢生理强度的变化及施氮对Bt棉Bt蛋白表达和氮代谢的影响，可为生产上合理调节Bt棉Bt蛋白稳定表达和氮代谢平衡提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试Bt棉分别为Bt冀668及晋棉26，亲本对照分别为常规棉冀668和晋棉7。Bt冀668和晋棉26均是通过农杆菌介导技术将Bt基因(Cry1Ac)导入各自对照常规棉而选育的Bt棉品种。种子均由山西省农业科学院棉花研究所提供。

1.2 试验设计

试验于2012-2013年在山西农业大学农场试验田和农学院生态实验室进行。

Bt棉功能叶Bt蛋白表达和氮代谢变化试验设计：供试棉花品种为Bt棉Bt冀668及晋棉26，亲本常规棉为冀668和晋棉7。以品种为试验因子，田间按单因素随机区组设计，每品种重复5次，共计20个小区，小区面积3.5 m× 7.5 m，行距75 cm，株距15 cm。试验地土壤为黄土母质上发育而成的石灰性褐土，其养分含量为：有机质12.84 g·kg-1，全氮0.86 g·kg-1，速效磷6.47 mg·kg-1，速效钾176.34 mg·kg-1。氮肥施用量300 kg·hm-2，氮肥用尿素，施过磷酸钙600 kg·hm-2、氯化钾 300 kg·hm-2，全部以基肥施入。4月20日种子经催芽后采用地膜覆盖穴播，每穴4粒种子，三叶定苗，其他田间管理按常规进行。分别于棉花苗期(7叶期，6月4日)、蕾期(6月21日)、花期(7月16日)、盛铃期(8月14日)、吐絮期(9月15日)，取棉株功能叶倒4叶，打顶后取倒2叶。每一小区每一生育期随机选取15株棉叶。一部分鲜样用于硝酸还原酶(NR)活性和可溶性蛋白质含量的测定；一部分样液氮冷冻后用于Bt蛋白、谷丙转氨酶(GPT)活性、蛋白酶活性的测定；其余样70℃烘干用于全氮含量的测定。

氮肥对Bt棉中后期功能叶Bt蛋白表达和氮代谢的影响试验设计：供试棉花品种为Bt棉晋棉26和亲本常规棉晋棉7。试验采用直径为35 cm，高为30 cm的聚乙烯塑料盆进行盆栽试验，每盆装土20 kg。采用地表2 m以下的生土，为黄土母质上发育而成的石灰性褐土，其养分含量为：有机质4.56 g·kg-1，全氮0.097 g·kg-1，速效磷3.86 mg·kg-1，速效钾75.41 mg·kg-1。设置不同的氮肥施用方式，分别为0.3125 g·kg-1土(全部基施)、0.3125/0.156 g·kg-1土(基施/初花期追施)、0.156/0.156 g·kg-1土(基施/初花期追施)以及CK 0 g·kg-1土。KH2PO40.2425 g·kg-1土以基肥一次施入。初花期追施的氮肥溶于水后浇入桶中，所用氮肥为尿素。每品种每处理重复12次，共96个盆。4月25日种子经催芽后播种，三叶定苗，每盆留苗一株，其他管理按田间常规进行。于棉株盛花期(7月25日)、盛铃期(8月16日)每处理随机选取6盆，取棉株功能叶倒4叶，打顶后取倒2叶。一部分鲜样用于可溶性蛋白质和硝酸还原酶活性的测定；一部分样液氮冷冻后用于Bt蛋白的测定。

1.3 测定项目与方法

Bt棉功能叶Bt蛋白含量采用ELISA试剂盒(购置于中国农业大学作物化控中心，其中包括被包被抗体的96孔板及配套试剂)进行测定[13]。

棉株功能叶硝酸还原酶活性的测定采用磺胺比色法[14]，谷丙转氨酶活性的测定采用比色法[14]，蛋白酶活性的测定采用比色法[14]，可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[14]，全氮含量的测定采用凯氏定氮法[15]。

1.4 数据分析

采用Excel和DPS软件对数据进行t检验或Duncan新复极差多重比较。

2 结果与分析

2.1 Bt棉功能叶Bt蛋白表达

由表1可见，2个Bt棉功能叶Bt蛋白含量均表现蕾期最高，苗期次之，从蕾期开始随生育进程呈显著下降趋势。Bt冀668功能叶Bt蛋白含量在生育前中期(苗期、蕾期和花期)显著高于晋棉26。表明不同Bt棉功能叶Bt蛋白表达有所不同，但均表现为营养生长为主阶段功能叶Bt蛋白含量显著增加，进入生殖生长后，开始显著下降。

表1 不同生育期Bt棉功能叶Bt蛋白含量/μg·g-1(M±SD)

注：同列标有* 或同行Bt棉不同生育期字母不同表示差异显著(plt;0.05)。

Note： * means significant difference at the 0.05 level in the same column; The different small letters mean significant difference at the 0.05 level in the same line.

2.2 Bt棉功能叶硝酸还原酶、谷丙转氨酶和蛋白酶活性变化

硝酸还原酶是氮素同化过程的第一个酶，硝酸还原酶对棉株体内外因素反应灵敏，被称为限速酶，其数量和活力对NO3-还原具有重大效应[16]。由表2可以看出，Bt棉功能叶硝酸还原酶活性在生长发育过程中和常规棉变化一致，苗期到蕾期活性增强，随后开始逐渐下降。但相同生育期功能叶NR活性，Bt棉和对照常规棉存在一定差异。除吐絮期外，其余生育期均表现Bt棉显著提高了功能叶NR活性，且在蕾期和花期增幅最大，Bt冀668增幅分别为40.28%和36.99%，晋棉26增幅分别为44.62%和32.28%。这表明Bt基因的插入提高了Bt棉功能叶NR活性，对N素还原能力增强。

表2 不同生育期棉株功能叶硝酸还原酶活性/μg·g-1·h-1(M±SD)

注：同列标有* 表示Bt棉与各自对照常规棉有差异(plt;0.05)。 表3、表5和表6同。

Note： * means significant difference at the 0.05 level in the same column between Bt cotton and conventional cotton, respectively. The same as table 3, 5, 6.

谷丙转氨酶主要参与氨基交换，形成植物体内的多种氨基酸。转氨基作用和氨基酸的合成主要在叶片中进行，因而叶片中的谷丙转氨酶活性变化可以直接反映棉株的氮素同化的基本特征。表3表明，2个Bt棉功能叶谷丙转氨酶活性变化为生长前期逐渐增强，到花期后开始逐渐降低，而2个常规棉谷丙转氨酶活性随生长发育一直增强到盛铃期后，才开始有所下降，且2个Bt棉谷丙转氨酶活性均在花期以前显著高于2个常规棉，这说明Bt基因插入后Bt棉氨基交换过程发生了变化，在前中期功能叶氨基酸合成能力显著增强，后期减弱早于常规棉。

表3 不同生育期棉株功能叶谷丙转氨酶活性/μmol·g-1·min-1(M±SD)

蛋白酶参与蛋白质分解的过程，产生的氨基酸用于新蛋白质的合成或进一步降解氧化、转化成其他物质。由表4可见，无论Bt棉还是常规棉，功能叶蛋白酶活性均在前中期较低，逐渐增强到盛铃期达高峰后有所降低。2个Bt棉与各自对照常规棉整个生育期功能叶蛋白酶活性均无显著差异。这一结果表明，Bt基因的插入对Bt棉功能叶蛋白质分解代谢没有产生显著影响。

表4 不同生育期棉株功能叶蛋白酶活性/mg·g-1·h-1(M±SD)

2.3 Bt棉功能叶可溶性蛋白质和全氮含量变化

表5显示，2个Bt棉和2个常规棉功能叶可溶性蛋白质含量的变化趋势一致，在蕾期含量达到最高后开始逐渐下降。在生长前中期(苗期、蕾期和花期)2个Bt棉显著提高了功能叶可溶性蛋白质含量，且在蕾期增幅最大，Bt冀668增幅为21.09%，晋棉26增幅为25.42%。结合Bt棉对功能叶蛋白酶活性的研究结果表明，Bt棉在生长前中期蛋白质的合成能力明显提高。

表5 不同生育期棉株功能叶可溶性蛋白质含量/mg·g-1(M±SD)

表6表明，Bt棉和常规棉功能叶全氮含量变化一致，苗期和蕾期功能叶全氮含量较高，这和田晓莉等盛蕾期之前是棉株一生中氮代谢最活跃的时期的结论是一致的[17]，以后全氮含量呈下降趋势。2个Bt棉功能叶全氮含量在生长前期(苗期和蕾期)显著高于2个常规棉，Bt冀668平均增幅达26.94%，晋棉26达28.30%。

表6 不同生育期棉株功能叶全氮含量/g·kg-1(M±SD)

注：同列标有* 表示Bt棉与各自对照常规棉有差异(plt;0.05)。

Note： * means significant difference at the 0.05 level in the same column between Bt cotton and conventional cotton, respectively.

2.4 Bt棉功能叶Bt蛋白与氮代谢指标相关性分析

Bt棉功能叶Bt蛋白含量在蕾期达最高，吐絮期降到整个生育期最低值，且与常规棉相比，Bt棉蕾期功能叶氮代谢指标大多数有显著改变，而吐絮期变化较少，为探明Bt棉氮代谢对Bt蛋白表达的响应，对Bt棉蕾期和吐絮期功能叶各项氮代谢指标与Bt蛋白含量进行相关分析。由表7可以看出，功能叶Bt蛋白含量在蕾期和吐絮期均与硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质含量以及全氮含量呈显著正相关，与其他氮代谢指标相关性较差。

表7 Bt棉功能叶Bt蛋白和氮代谢指标相关系数

注：*表示显著相关(plt;0.05).

Note： * means significant correlation at the 0.05 level.

2.5 氮肥对Bt棉功能叶Bt蛋白表达的影响

表8显示，施氮肥Bt棉功能叶Bt蛋白含量在盛花期和盛铃期显著高于不施氮处理，表明施氮肥可显著提高Bt棉中后期功能叶Bt蛋白的表达。初花期增施氮肥比基施又有显著提高，其中以基施基础上再增施50%氮肥(0.3124/0.156 g·kg-1处理)功能叶Bt蛋白含量达最高，在盛花期、盛铃期分别是不施氮处理的2.32、4.34倍，比单基施氮肥(0.3124 g·kg-1处理)分别增幅39.58%、67.24%。施氮肥Bt棉功能叶Bt蛋白含量从盛花期到盛铃期下降的幅度均小于不施氮处理，如从盛花期到盛铃期施氮肥0.3124、0.3124/0.156、0.156/0.156 g·kg-1下降幅度分别为65.52%、38.14%、48.20%，而对照为158.21%。

表8 氮肥对Bt棉晋棉26功能叶Bt蛋白含量的影响/μg·g-1(M±SD)

注：同一列字母不同的表示有差异(plt;0.05)

Note：The different small letters in the same column mean significant difference at the 0.05 level.

2.6 氮肥对Bt棉功能叶硝酸还原酶活性和可溶性蛋白含量的影响

由表9可见，施氮肥Bt棉在盛花期和盛铃期功能叶硝酸还原酶活性和可溶性蛋白含量均比不施氮肥显著提高，表明充足的氮素供应可显著提高Bt棉中后期功能叶硝酸还原酶活性和可溶性蛋白含量，基施和初花期各50%的效应显著大于全部基施，在基施基础上，在初花期再增施50%氮肥(0.3124/0.156 g·kg-1处理)提高最明显。同一施氮处理，Bt棉功能叶硝酸还原酶活性和可溶性蛋白含量均显著高于常规棉，Bt棉施氮较不施氮功能叶硝酸还原酶活性和可溶性蛋白含量增加的幅度也均高于常规棉增加的幅度，如硝酸还原酶活性，施氮肥0.3124/0.156 g·kg-1Bt棉在盛花期和盛铃期增加幅度分别为49.64%和90.74%，常规棉增加的幅度分别为42.67%和68.22%，可溶性蛋白含量, 施氮肥0.3124/0.156 g·kg-1Bt棉在盛花期和盛铃期增加幅度分别为40.69%和74.54%，而常规棉增加的幅度分别为29.86%和37.37%，显示增施氮肥更有利于Bt棉中后期功能叶硝酸还原酶活性和可溶性蛋白含量提高。

表9 氮肥对棉株功能叶硝酸还原酶活性和可溶性蛋白含量的影响(M±SD)

注：同一列字母不同的表示差异显著(plt;0.05)

Note：The different small letters in the same column mean significant difference at the 0.05 level.

3 讨论与结论

3.1 Bt棉功能叶氮代谢对Bt蛋白表达的响应

试验结果表明， Bt棉功能叶在营养生长为主阶段Bt蛋白含量显著增加，进入生殖生长后，显著下降。这与前人研究Bt棉Bt蛋白在棉花不同生育期的表达具有时间特性是一致的[13,18,19]。棉株由营养生长中心向生殖生长转变的过程中，蕾花铃对氮素营养的需求量逐渐增加，抑制了叶片中Bt蛋白的合成[20]。有研究表明，随转Bt棉生育期的推进，在生育后期，Bt基因的表达减弱，叶片中将基因转换成Bt蛋白的RNA几乎全部丧失，植株不能继续产生Bt蛋白，导致其含量下降[21]。因此寻求促进中后期叶片Bt蛋白表达量增加的措施，对于增强Bt棉的中后期抗虫性具有重要意义。

试验结果表明，Bt棉功能叶硝酸还原酶活性提高，在前中期谷丙转氨酶活性显著增强，说明Bt基因插入更有利于氮素的还原和同化。Bt棉功能叶蛋白酶活性没有发生显著变化，显著提高了功能叶可溶性蛋白质含量，前期显著提高了全氮含量，这表明Bt基因插入后，Bt棉在生长前中期蛋白质的合成能力明显提高。孙彩霞等[4]对Bt棉苗期氮代谢研究表明，与非转基因棉花相比，苗期Bt棉Z30叶片内氮素的同化和蛋白质的水解过程没有明显改变,而氨基交换过程可能发生改变，推测苗期Bt棉体内的Bt蛋白的表达量较低，因而其对植株氮代谢特征影响也较小，建议对Bt棉各生育期的氮代谢特征进行研究。田间条件下Bt棉的氮代谢较强，叶片全氮含量明显升高，可溶性蛋白质含量显著提高，叶片硝酸还原酶、谷丙转氨酶活性增强，蛋白酶活性则明显下降[22]，本研究结果与此研究结果基本一致。

Bt蛋白的表达就是氮素合成蛋白的氮代谢过程，董志强等[23]研究表明，Bt棉33B的氮代谢特征影响了其Bt蛋白的表达量。本试验结果显示功能叶Bt蛋白与硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质含量以及全氮含量呈显著正相关，与前人研究Bt棉体内Bt蛋白表达量与氮代谢水平呈显著正相关[24～27]一致，表明增强的氮代谢有利于Bt蛋白的表达。Bt棉主茎幼叶、功能叶和衰老叶片中硝酸还原酶活性和可溶性蛋白含量呈显著正相关关系，认为Bt棉主茎叶片中硝酸还原酶活性和叶片可溶性蛋白的合成量密切相关，即叶片硝酸还原酶调控着可溶性蛋白的合成量[23]。本试验结果表明Bt棉蕾期和吐絮期功能叶硝酸还原酶活性和可溶性蛋白含量也呈显著正相关，相关系数分别为0.781(r0.05=0.632)和0.749。结合本试验硝酸还原酶活性和Bt蛋白的显著相关关系，可以推测硝酸还原酶活性显著影响可溶性蛋白质和Bt蛋白的合成量。试验结果还表明，蕾期Bt冀668功能叶硝酸还原酶活力为18.84 μg·g-1·h-1，相当于吐絮期活力的2.60倍，可溶性蛋白含量和Bt蛋白含量分别是吐絮期的2.26倍和3.93倍，因此推测Bt棉中后期Bt蛋白表达量的下降与中后期硝酸还原酶活性减弱和可溶性蛋白含量降低密切相关。

3.2 氮肥对Bt棉功能叶Bt蛋白表达及氮代谢的调节

当施氮肥时，Bt作物可利用的氮随之增加，Bt蛋白合成酶和mRNA的数量可能会大量增加，因此将会有大量的Bt蛋白被合成[12]。研究表明在合理的施用率范围内，施氮肥可显著提高Bt棉中后期(盛花期和盛铃期)功能叶Bt蛋白的表达，使中后期Bt蛋白含量下降幅度减少，从而有利于中后期抗虫性的增强。氮肥运筹为基施和初花期各50%的效应显著大于全部基施，而在基施氮肥基础上，初花期增施50%的氮肥效应最明显，表明整个生育期充足的氮肥供应显著提高功能叶Bt蛋白的表达。Pettigrew等[20]的研究也表明尽管不同的氮肥处理由于产量构成因素之间的不同，导致在皮棉产量上最终没有形成显著差异，但相同氮肥基施量下，后期增施50 %的氮肥使叶片Bt蛋白含量提高了14%。

氮肥是生产上可以调节的一个栽培措施，氮素营养充足，棉叶各代谢过程增强[28]，开花期追施适量氮肥，在一定程度上可以改善棉叶光合性能，维持硝酸还原酶活性，使生育叶片后期维持较高生理活性[29]，马宗斌等[30]研究表明氮肥施用方式(氮肥分施比例)会影响Bt棉氮代谢。高氮素营养有利于Bt棉的硝酸还原酶活性的提高，但这一点在亲本棉上没有明显表现出来。在高氮素水平处理下，Bt棉的氮素代谢较亲本棉花旺盛[31]。本研究也得出类似的结果。研究表明施氮肥明显提高Bt棉中后期功能叶硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质含量，与常规棉比较，增施氮肥更有利于Bt棉中后期功能叶硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质含量提高。基施和初花期各50%的效应显著大于全部基施，在基施基础上，在初花期再增施50%氮肥(0.3124/0.156 g·kg-1处理)提高最明显。氮肥施用量和施用方式可显著改变Bt棉功能叶氮代谢水平，因此，生产中可通过氮肥调节来促进Bt棉氮代谢和提高Bt棉中后期抗虫性。

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ResponseofNitrogenMetabolisminFunctionalLeaftoBtProteinExpressionandNitrogenFertilizerAdjustmentforBtCotton

Li Xiaorong, Zhang Meijun, Yang Wude, Feng Meichen, Wu Zhiming

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

To investigate the effect of Bt gene and N fertilizer on Bt protein and nitrogen metabolism of functional leaf of Bt cotton, Bt protein content, nitrate reductase (NR) activity, glutamic-pyruvic transaminase (GPT) activity, protease activity, soluble protein content and total N content of functional leaf were measured in this study. The results showed that Bt protein content in functional leaf of Bt cottons reached the highest at budding stage. From then on, Bt protein content reduced significantly. Compared with conventional cottons, the NR activity of functional leaf of Bt cottons was enhanced, also the GPT activity and soluble protein content was increased significantly before flowering stage, and the total nitrogen content was increased significantly before budding stage, while there was no significant effect on protease activity. There was a significant positive correlation between Bt protein content and NR activity, soluble protein content and total nitrogen content. It concluded that the enhanced nitrogen metabolism at early stage promoted the Bt protein expression. N fertilizer improved Bt protein expressing, NR activity and soluble protein content of functional leaf of Bt cotton at middle and later stages. 50% of N fertilizer respectively at the basal and the early flowering stages affected much more than that of N fertilizer at all the basal stage. And on all basis N fertilizer, the effect of increasing 50% of the nitrogen fertilizer application at early flowering stage was the most significant. Compared with conventional cotton, N fertilizer was more helpful for the increasing of NR activity and soluble protein content of functional leaf for Bt cotton at middle and later stages.

Bt cotton; Bt protein; Nitrogen metabolism; N fertilizer

2014-03-20

2014-05-16

李晓荣(1990-), 女(汉), 陕西延安人，在读硕士,研究方向: 作物生态。

张美俊, 博士,副教授。Tel:0354-6288982;E-mail: meijunz@126.com

山西省自然科学基金(2012011030-2)

S183

A

1671-8151(2014)04-0301-07

(编辑：马荣博)