DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β在宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义

黄 裕 姜青明 唐 郢 王 冬

宫颈癌的发生是多因素、多步骤的过程，多种因素和多个信号转导途径在其发生、发展过程中发挥作用，细胞信号传导通路具有重要调节作用，信号传导异常可能引起分化异常甚至恶化。DKK-1(Dickkopf-1)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β)、磷酸化的GSK-3β(PGSK-3β)均是参与Wnt肿瘤信号通路的重要成分，本研究采用免疫组织化学方法测定三者在不同宫颈组织中的表达，并结合临床病理因素，分析它们在宫颈鳞癌发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 样本采集

收集2010年1月至2013年5月间在我院门诊活检或手术治疗的95例正常或病变宫颈组织标本，所有患者术前均未接受放化疗。其中慢性宫颈炎25例，宫颈上皮内瘤变(CIN)29例，宫颈鳞癌41例，年龄29～72岁，平均(45.5±6.7)岁。同时记录宫颈鳞癌患者临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移及组织分化等临床病理资料。

1.2 试剂和仪器

浓缩型兔抗人DKK-1多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，兔抗人GSK-3β多克隆抗体和兔抗人PGSK-3β多克隆抗体(美国Cell Signaling公司)，浓缩型DAB显色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，光学显微镜和Olympus DP70图像采集系统(日本Olympus公司)。

1.3 实验方法

取宫颈组织的石蜡包埋标本，制成4 μm厚度连续切片，采用免疫组织化学染色检测其中DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β的表达。高压锅法修复抗原，加入适当稀释的一抗(DKK-1稀释度为1∶100，GSK-3β和PGSK-3β稀释度为1∶50)，滴加试剂SABC室温孵育30 min，使用DAB试剂盒进行显色。

1.4 结果判定

依据染色细胞比例和染色强度进行综合评分。在高倍光镜下(×200)挑选5个视野，每个视野计数200个细胞。阳性标准为细胞核和(或)细胞质着色。染色细胞比例的积分标准为：阳性细胞数<10%为0分，10%～19%为1分，20%～50%为2分，>50%为3分。染色强度积分标准为：无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将染色细胞比例和染色强度两项积分相乘，总分为0～2分为阴性表达，3～9分为阳性表达。应用Image-pro5.0图像分析软件计算阳性细胞平均光密度。

1.5 统计学处理

数据均应用SPSS 16.0软件进行处理，计数资料采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β在宫颈组织中的表达

DKK-1阳性表达主要定位于细胞质中，慢性宫颈炎组织中其阳性表达率为84.0%，从癌前病变发展至癌，DKK-1阳性表达率逐渐降低。慢性宫颈炎、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ～Ⅲ组织中DKK-1阳性表达率均明显高于宫颈癌(P均<0.05)。GSK-3β阳性表达主要定位于细胞核中，慢性宫颈炎组织中GSK-3β阳性表达率明显高于宫颈癌(P<0.05)。PGSK-3β阳性表达主要定位于细胞质中，慢性宫颈炎组织中PGSK-3β阳性表达率明显低于宫颈癌(P<0.05)，见表1。

表1 DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β在各宫颈组织中的表达(例，%)

a为与宫颈癌比较，P<0.05。

2.2 各宫颈组织中GSK-3β和PGSK-3β阳性颗粒平均光密度

GSK-3β蛋白表达在宫颈癌组织中的表达量最高。PGSK-3β蛋白在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ-Ⅲ及宫颈癌组织中的表达量明显高于慢性宫颈炎，差异具有统计学意义(P<0.05)；CIN Ⅰ中PGSK-3β蛋白表达量最高，与宫颈癌组织比较差异显著(P<0.05)，但随着病情的发展逐渐呈下降趋势，见表2。

表2 各宫颈组织中GSK-3β和PGSK-3β阳性颗粒平均光密度

注：a为与宫颈癌比较，P<0.05；b为与慢性宫颈炎比较，P<0.05。

2.3 DKK-1及PGSK-3β表达与宫颈鳞癌临床病理特征的关系

DKK-1阳性表达率与宫颈鳞癌组织分化、FIGO临床分期及有无淋巴结转移显著相关(P<0.05)；而与患者年龄、肌层浸润程度无相关性(P>0.05)；PGSK-3β阳性表达率与宫颈鳞癌组织分化、FIGO临床分期及有无淋巴结转移显著相关(P<0.05)；与患者年龄、肌层浸润程度无相关性(P>0.05)，见表3。

表3 DKK-1、PGSK-3β表达与宫颈鳞癌临床病理特征的关系(例，%)

3 讨论

DKK-1是1个分泌型糖蛋白，属于DKK家族成员，是1种有力的Wnt信号途径拮抗剂。DKK-1通过诱导形成1种三元复合物，产生内吞作用，发挥抑制功能，造成Wnt经典信号传导途径阻断，从而诱导体内多种肿瘤细胞发生凋亡[1-3]。DKK-1在宫颈癌的发生、发展中具有重要作用，在宫颈癌细胞株Hela中DKK-1表达沉默，从Hela细胞株培养分离出的非致瘤性回复突变株中DKK-1高表达[4]。崔素芬等[5]对36例宫颈癌组织标本进行DKK-1阳性表达检测，结果显示DKK-1阳性表达呈现明显下调。本研究中DKK-1在宫颈组织中阳性表达主要定位于细胞质中，慢性宫颈炎、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ～Ⅲ、DKK-1阳性表达率均明显高于宫颈鳞癌中的阳性表达率(P<0.05)。从慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变发展至宫颈浸润鳞癌，DKK-1的阳性表达率依次降低，提示DKK-1表达沉默在宫颈癌发生中存在重要作用，与文献报道的研究结果相一致。研究DKK-1表达下调机制发现宫颈癌Hela细胞的致瘤性生长过程中需要关闭DKK-1基因，有异常甲基化出现于Hela细胞内的DKK-1基因启动子区，可能与组蛋白降解也存在相关性[6]。本研究还发现，DKK-1的阳性表达率在不同年龄、肌层浸润分组间表达差异无统计学意义(P>0.05)，在不同组织分化、临床分期及有无淋巴结转移分组间表达差异显著(P<0.05)，提示DKK-1阳性表达高低可能有助于判定宫颈浸润癌的预后。

GSK-3β作为1种多功能丝/苏氨酸蛋白激酶，广泛参与细胞周期、细胞骨架的稳定和基因表达等细胞基本功能的调节，PGSK-3β是磷酸化氮端9位丝氨酸后的GSK-3β失活形式，在肿瘤发生、发展、转移、耐药等密切相关信号转导通路中发挥重要调节作用，是一个重要肿瘤相关因子。GSK-3β在皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等上皮性肿瘤中均出现异常表达[7-8]，本研究显示PGSK-3β的阳性表达率在不同组织分化、FIGO临床分期及有无淋巴结转移分组间表达差异具有统计学意义(P<0.05)，提示PGSK-3β表达可能是宫颈癌预后不良的独立危险因素。另外研究还发现GSK-3β在宫颈组织中阳性表达主要定位于细胞核，从慢性宫颈炎、CIN发展为宫颈浸润癌的过程中，GSK-3β阳性颗粒平均光密度呈逐渐下降趋势，但在宫颈癌组织中表达最高。而PGSK-3β在宫颈组织中阳性表达主要定位于细胞质中，在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ～Ⅲ及宫颈鳞癌组织中的蛋白表达量明显高于慢性宫颈炎(P<0.05)；PGSK-3β在CIN Ⅰ时的蛋白表达量最高，与宫颈癌比较差异显著(P<0.05)，并随着病程的发展逐渐呈下降趋势。GSK-3β在慢性宫颈炎组织中保持较高的表达水平，有着较强的激酶活性，而PGSK-3β磷酸化蛋白在癌组织中的高水平表达，说明GSK-3β的激酶活性被明显抑制。

值得关注的是，GSK-3β在肿瘤发生中具有矛盾的两面性，不少抑制GSK-3β表达的实验研究表明GSK-3β具有促进肿瘤发生的作用[9-10]。PGSK-3β作为失活形式并不直接表明GSK-3β的活性程度，因此尽管DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β阳性表达预示了宫颈癌患者的不良预后，但具体作用机制尚待进一步研究。

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