鼻咽癌干细胞标志物的检测意义

江庆萍 谢思明 王 爽 储 兵 姚开泰

肿瘤干细胞在肿瘤发生发展和治疗中都起着至关重要的作用，所以在肿瘤研究中是不可回避的关键问题。2007年，Wang等[4]用免疫荧光法检测CK8、CK18和CK19在SP细胞和NSP细胞中的表达，发现CK8和CK18在两种细胞中均强表达，而CK19只在SP细胞中有14.5%的表达，非SP细胞中未见表达，据此作者认为CK19是鼻咽癌干细胞一个潜在的重要分子标志，并被各类文献引用。而CD133被作为多种肿瘤的干细胞标志物为大家所熟知。本文将通过检测CK19、CD133在正常鼻咽黏膜、鼻咽癌组织、永生化和鼻咽癌细胞株中的表达，进一步确定鼻咽癌干细胞表面标志物。

1 材料与方法

1.1 材料

选取广东省中山市人民医院病理科附有正常黏膜和非典型增生的鼻咽癌组织标本39例，其中男性19例，女性20例，年龄23～73岁，并另选取11例正常鼻咽黏膜上皮组织作为对照。细胞株：5-8F、6-10B，低分化鼻咽癌细胞系，由中山大学附属肿瘤医院肿瘤研究所建立，生长培基为PRMI1640+10%FCS，细胞呈上皮样、贴壁生长，具有高成瘤和高转移能力。CNE2:低分化鼻咽癌细胞系，南方医科大学肿瘤研究所建立，生长培基为PRMI1640+10%FCS，细胞呈上皮样、贴壁生长。NP69:鼻咽永生化细胞系，由中山大学附属肿瘤医院肿瘤研究所建立，生长培基为Keratinocyte-SFM(GIBCO)，细胞呈上皮样、贴壁生长。抗体：CD133/1(AC133)单克隆抗体购自德国Miltenyi公司，CK19(GM088801)、CK14(LL002)为中国福州迈新公司产品，CK8(35βH11)、CK18(DC10) 购于美国KAKO公司。免疫组化SP试剂盒、DAB染色试剂盒均为中国福州迈新生物技术公司产品。裸鼠：BALB/c-nude裸鼠，4～6周龄，雌性，购自南方医科大学动物实验中心，等级为无特定病原体动物(specific pathogen-free animals，SPF)。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠体内成瘤 5-8F、6-10B和CNE2细胞处于对数生长期时，以1×106个细胞分别注入2只裸鼠双侧腋下，观察成瘤情况。8周后，取出瘤块，固定、石蜡包埋并切片。

1.2.2 免疫组化SP 按试剂说明书进行，微波修复10 min，CD133抗体稀释浓度为1∶50；DAB显色；中性树胶封片。

1.2.3 免疫细胞化学法 洁净玻片高压消毒，滴上细胞，培养24 h细胞完全爬片后终止培养，免疫细胞化学为SP法，按试剂说明书进行，CD133抗体稀释浓度为1∶50；DAB显色；中性树胶封片。

1.2.4 免疫组化结果判断方法 按细胞着色评分：棕褐色 3分；棕黄色 2分；淡黄色 1分；无着色 0分。按阳性细胞数评分：一个视野内阳性细胞数>75% 为4分；51%～75%为3分；11%～50%为2分；1%～10% 为1分；无阳性细胞为0分。上述两项得分相乘为最后结果，3分为“+”；4分为“++”； 5分以上为“+++”。“+～+++”为阳性表达。

1.2.5 PCR检测3种癌细胞株中CD133基因 提取5-8F、6-10B和CNE2的RNA，对经检测完好的RNA进

行逆转录反应，按照PrimeScriptTM 逆转录试剂盒说明书进行cDNA的合成，-20 ℃保存备用。

PCR反应。反应体系：10×buffer 1μl，Taq酶0.15 μl；dNTP 0.8 μl；上游引物0.2 μl，下游引物0.2 μl，cDNA 0.5 μl，H2O 7.15 μl，总体积 10 μl。反应条件：93 ℃预变性2 s；然后为93 ℃ 10 s、51 ℃ 10 s、72 ℃ 5 s，30个循环，最后72 ℃ 5 min。取5 μl 产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳以检测CD133基因是否存在。

2 结果

2.1 CK19在鼻咽癌和黏膜慢性炎组中的表达

结果发现CK19在大部分鼻咽癌组织中呈强阳性表达(37/39，67.2%)。黏膜慢性炎柱状上皮中呈强阳性表达，化生鳞状上皮中呈阳性表达。

2.2 CK19在鼻咽癌细胞株及其裸鼠移植瘤中的表达

检测了CK19在5-8F、6-10B和CNE2裸鼠移植瘤中的表达情况，结果发现CK19在3种移植瘤中都有散在点巢状阳性。CK19在5-8F、6-10B和CNE2 3个细胞株中均呈阴性表达。

2.3 免疫组化检测鼻咽癌组织中CD133表达

39例鼻咽癌组织中8例仅有个别癌巢的边缘见散在CD133+细胞，2例黏膜上皮主要是基底部细胞CD133呈阳性。11例鼻咽黏膜组织中未见CD133阳性细胞。

2.4 免疫细胞化学检测永生化细胞株NP69和癌细胞株中CD133表达情况

鼻咽永生化细胞株NP69中见散在的CD133+细胞，在10个高倍视野下阳性细胞率平均为1.5%。但3种癌细胞株5-8F、6-10B和CNE2细胞爬片连续6次免疫细胞化学检测均未发现阳性细胞，考虑原因可能是在这些细胞株中CD133+细胞含量很低或者CD133表达很弱，导致在细胞爬片这种有限的细胞数量中难以检出，故进一步采用PCR法验证这3种癌细胞株中是否有CD133基因表达。

2.5 PCR检测3种鼻咽癌细胞株中CD133的存在

5-8F、6-10B和CNE2细胞分别提取RNA，逆转录为cDNA，进行CD133基因PCR反应，以GAPDH为内参，重复两次。1%凝胶电泳结果两次完全一致，结果显示100～200 bp间CD133基因在3个细胞株均有清晰的条带(图1)。

1为5-8F-GAPDH;2为5-8F-CD33;3为 6-10B-GAPDH;4为6-10B-CD133;5为CNE2-GAPDH;6为CNE2-CD133。

图1 凝胶电泳检测CNE2、6-10B和5-8F鼻咽
癌细胞株中CD133表达

3 讨论

3.1 CK19的表达特征及能否作为NPC干细胞标志物的分析

上皮组织因为有上皮特有的角蛋白表达，人们通常在研究上皮组织正常和肿瘤干细胞标志物时常试图寻找是否有角蛋白标志物。1996年，Michel等[1]证实了CK19为皮肤干细胞标记物。2001年，Collins[2]发现前列腺干细胞表达α2β1和CK5及CK14。2006年，Ricci-Vitiani等[3]证明结肠癌干细胞CD133+CK20-。2007年，Wang等[4]用免疫荧光法检测CK8、CK18和CK19在SP细胞和NSP细胞中的表达，发现CK8和CK18在2种细胞中均强表达，而CK19只在SP细胞中有14.5%的表达，认为CK19是鼻咽癌干细胞一个潜在的重要分子标志。但我们的试验结果让我们对CK19是否为鼻咽癌干细胞标志物提出了疑问。在对鼻咽癌组织、细胞株裸鼠皮下移植瘤和细胞株进行CK19检测时发现，虽然CK19在3个细胞株5-8F、6-10B和CNE2中几乎没有见到阳性细胞表达，但3个细胞株移植瘤中CK19呈灶性或散在表达，鼻咽癌标本中67.2%的癌组织更呈弥漫强阳性表达，黏膜慢性炎和鼻咽癌癌旁腺上皮均阳性，部分化生鳞状上皮也阳性。根据干细胞概念，它们是一群稀少的保持数量恒定和具有自我更新能力的细胞，而在鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎中CK19如此广泛地表达，我们认为把它作为干细胞标志物是不恰当的。它在细胞株、裸鼠移植瘤和鼻咽癌以及黏膜慢性炎组织中的表达水平不同可能与细胞所处微环境有关，而非因为是干细胞标志物。

3.2 CD133分布特性及作为鼻咽干细胞标志物可能性研究

Prominin-1(别名CD133，AC133) 分子是1个有5个跨膜域的独特糖蛋白,它最早于1997年在小鼠神经上皮干细胞中发现，并因为它在细胞膜上明显的突出定位被命名为Prominin-1[5]。在多细胞生物中Prominin-1普遍表达，分布广泛。在小鼠Prominin-1发现的同年，Yin等[6]从胎儿肝脏，骨髓和脐带血中分离出的CD34+造血干细胞发现了Prominin-1人类同系物AC133(CD133)。后来，人们在造血系统外的不同器官和组织中都相继发现CD133+细胞具有干细胞功能。VEGF-R2+的内皮组细胞上CD133阳性表达，随着这些细胞的成熟，CD133表达迅速减弱[7]。

不仅在正常间叶和上皮组织中人们发现CD133+细胞具有干细胞的功能，在肿瘤组织中人们也发现多种肿瘤干细胞即“肿瘤干细胞”表达CD133。如神经胶质瘤、结肠癌、前列腺癌等[8-10]。那么，CD133是否也是鼻咽组织和癌细胞的干细胞标志呢？目前相关文献研究很少。

本实验首先利用免疫组织化学和免疫细胞化学观察鼻咽黏膜慢性炎标本和附有不典型增生的鼻咽癌组织CD133以及黏膜正常上皮细胞、永生化细胞和癌细胞株中的表达情况，从而了解CD133是否有成为鼻咽干细胞标志物的可能。结果发现，在39例鼻咽癌中有8例在散在癌巢边缘区域见有散在CD133阳性细胞分布，2例鼻咽上皮基底部阳性，11例黏膜慢性炎均阴性。从结果分析，虽然39例癌组织只有8例有阳性，但因为鼻咽部局限，并且取材标本只有数毫米大小，只占癌组织的极个别部位，所以不能认为其他31例没有CD133阳性细胞。从以往关于其他肿瘤和正常组织中干细胞分布位置和数量的研究[11-12]以及本作者LRCs的探讨中发现肿瘤细胞常分布于癌巢边缘和上皮基底部，并且数量稀少，我们的免疫组化结果同此特征相符合，从而从组织学角度证明CD133可以假设为鼻咽干细胞标志物进行以后的分离和特性鉴定试验。

永生化细胞株NP69及鼻咽癌细胞株免疫细胞化学检测发现，NP69有散在的CD133+细胞存在,其中后者十个高倍视野下有1.5%，而鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B和CNE2重复数次均未检测到CD133表达。我们把3种癌细胞行qRT-PCR反应，结果显示5-8F、CNE2和6-10B均见明显清晰的条带。综上所述，我们认为CD133可能是鼻咽正常和肿瘤干细胞标志物。2013年，也有学者证实CD133为鼻咽癌干细胞标记物[13]。

根据CK19在鼻咽癌和黏膜慢性炎标本、鼻咽癌细胞株移植瘤和细胞株中的表达情况，提出CK19并非为鼻咽癌干细胞标志物，它表达的不同可能与癌细胞所处微环境不同有关。从组织和细胞学水平上观察，我们认为CD133是鼻咽癌可能干细胞标志物，为后续研究打下基础。

[1] Michel M,Trk N,Godbout MJ，et al.Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro:keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites,and their number varies with donor age and culture stage〔J〕.J Cell Sci,1996，109(Pt 5):1017-1028.

[2] Ricci-Vitiani L,Lombardi DG,Pilozzi E,et al.Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells〔J〕.Nature,2007，445(7123):111-115.

[3] Collins AT,Habib FK,Maitland NJ,et al.Identification and isolation of human prostate epithelial stem cells based on alpha(2)beta1-integrin expression〔J〕.J Cell Sci,2001，114(Pt 21):3865-3872.

[4] Wang J,Guo LP,Chen LZ，et al.Identification of cancer s-

tem cell-like side population cells in human nasopharyngeal carcinoma cell line〔J〕.Cancer Res,2007，67(8):3716-3724.

[5] Weigmann A,Corbeil D,Hellwig A,et al.Prominin,a novel microvilli-specific polytopic membrane protein of the apical surface of epithelial cells,is targeted to plasmalemmal protrusions of non-epithelial cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1997，94(23):12425-12430.

[6] Ying Z,Gonzalez-Martinez J,Tilelli C,et al.Expression of neural stem cell surface marker CD133 in balloon cells of human focal cortical dysplasia〔J〕.Epilepsia，2005，46(11):1716-1723.

[7] Peichev M,Naiyer AJ,Pereira D,et al.Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34(+) cells identifies a population of functional endothelial precursors〔J〕.Blood,2000，95(3):952-958.

[8] Lottaz C,Beier D,Meyer K,et al.Transcriptional profiles of CD133+ and CD133- glioblastoma-derived cancer stem cell lines suggest different cells of origin 〔J〕.Cancer Res,2010，70(5):2030-2040.

[9] Xi HQ,Zhao P.Clinicopathological significance and prognostic value of EphA3 and CD133 expression in colorectal carcinoma〔J〕.J Clin Pathol,2011,64(6):498-503.

[10] Vander Griend DJ,Karthaus WL,Dalrymple S,et al.The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells〔J〕.Cancer Res,2008，68(23):9703-9711.

[11] Beier D,Hau P,Proescholdt M,et al.CD133(+) and -CD

133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles〔J〕.Cancer Res,2007，67(9):4010-4015.

[12] Ricci-Vitiani L,Lombardi DG,Pilozzi E,et al.Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells〔J〕.Nature，2007，445(7123):111-115.

[13] Zhuang HW,Mo TT,Hou WJ,et al.Biological characteristics of CD133+ cells in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Oncol Rep，2013，30(1):57-63.