LY-294002对人宫颈癌细胞株Bcl-2表达的影响

董莹莹 李 威

(辽宁省妇幼保健院妇产科，辽宁 沈阳 110005)

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，它介导的下游多种信号转导通路的激活调节细胞的多种生理过程，包括细胞的增生、分化、凋亡。研究发现，PI3K/Akt参与了细胞的正常生理活性的调节，且只在细胞恶性转化时表达是增加的，其过度表达对肿瘤的发生发展起着至关重要的作用〔1～3〕，但是，在宫颈癌的病理过程中，PI3K/Akt能否通过调节Bcl-2的表达参与肿瘤细胞的凋亡过程尚不清楚，需进一步研究。本研究采用Western 印迹和RT-PCR方法，检测经不同浓度的PI3K抑制剂(LY-294002)处理的人宫颈癌细胞株的Bcl-2的表达变化，探讨PI3K在宫颈癌的病理作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 人宫颈癌Hela细胞购自中国科学院细胞所；RPMI-1640培养基购自Gibco BRL公司；PI3K抑制剂LY294002购自碧云天生物技术研究所，分子量307.3；鼠抗人单克隆Bcl-2购于美国Santa Cruz公司。

1.2细胞培养 人宫颈癌Hela细胞置于37 ℃，饱和湿度，5%CO2恒温培养箱中常规消化传代。以含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的培养液RPMI-1640培养，根据细胞生长状态每2～3 d传代1次。取生长状态稳定，呈对数生长期细胞用于实验。

1.3实验分组 实验使用细胞均为接种24 h后处于对数生长期细胞，分为对照组和LY294002干预组，干预组再细分为4个亚组，分别以终浓度为 5、10、20、40 μmol/L 的PI3K抑制剂LY294002处理人宫颈癌Hela细胞，作用48 h。

1.4Western印迹方法检测各实验组Bcl-2蛋白的表达 用蛋白裂解液RIPA(50 mmol/L Tris-base、1.0 mmol/L EDTA、150 mmol/NaCl、 0.1%SDS、1%TritonX-100、1% Sodium deoxycholate)及蛋白酶抑制剂(USA)提取细胞蛋白，用考马斯亮蓝G250结合法，测定蛋白浓度，计算加样量。加入样品缓冲液，沸水浴中加热5 min使蛋白质变性，制备12%分离胶，4%浓缩胶，电泳，5%脱脂奶粉TTBS缓冲液4 ℃过夜。一抗鼠抗人单克隆Bcl-2、β-actin (1∶200) 室温孵育2 h，洗膜，辣根酶标记羊抗鼠IgG-HRP (1∶5 000)室温孵育2 h，洗膜后， ECL发光，暗室曝光显影，凝胶成像分析系统上摄像分析，计算出各组样品鼠抗人单克隆Bcl-2目标带的光密度值与内参照β-actin 光密度值的比值。

1.5RT-PCR方法检测各实验组Bcl-2 mRNA的表达 按照Trizol(Gibco，USA)剂盒说明书的操作步骤进行总mRNA提取，然后以逆转录(RT法)先合成cDNA，再进行PCR扩增；Bcl-2的上、下游引物分别为：上游5′-TGAGTTCGGTGGGGTCAT-3′；下游为：5′-GGAGAAATCAAACAGAGGC-3′，扩增产物全长187 bp。β-actin的上游引物：5′-GAGACCTTCAACACCCAGCC-3′；下游引物为：5′- GCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3′，扩增产物全长374 bp。扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳，UVP凝胶显像仪扫描并进行图像分析。以目的基因与β-actin光密度的比值代表目的基因的相对表达含量。

1.6统计学处理 采用SPSS13.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1Western 印迹检测Bcl-2蛋白表达 对照组宫颈癌细胞株有大量的Bcl-2阳性表达(0.43)，在以终浓度为 5 μmol/L的LY294002处理48 h后，宫颈癌细胞株的Bcl-2阳性表达迅速降低(0.32)，与对照组相比差异显著(P<0.05)，而且随着LY294002终浓度的升高，宫颈癌细胞株的Bcl-2阳性表达也随之降低(0.25，0.23，0.2)。见图1。

1～5：对照组、5、10、20、40 μmol/L LY294002干预组，下图同

2.2RT-PCR检测Bcl-2 mRNA表达 Bcl-2 mRNA在对照组宫颈癌细胞株即有大量的表达(0.8)，与对照组相比在经终浓度为5 μmol/L的LY294002处理后，实验组宫颈癌细胞株的Bcl-2 mRNA的表达迅速降低(0.5，P<0.05)，而且随着处理宫颈癌细胞株的抑制剂LY294002终浓度的升高，实验组宫颈癌细胞株的Bcl-2 mRNA的表达也随之降低(0.4，0.35，0.3)。见图2。

图2 RT-PCR检测Bcl-2 mRNA表达

3 讨 论

PI3K是由催化亚单位(p110)和调节亚单位(PIK3R1)组成的异源二聚体，PI3K负责下游作用底物磷酸磷脂酰肌醇肌醇环上的3＇羟基进行磷酸化，从而使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇转变为3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇，这是许多细胞外生长因子刺激的关键活化步骤。磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶B(P13K/Akt)信号转导通路广泛存在于细胞中，对细胞的生存起着至关重要的调节作用〔4〕。P13K/Akt信号转导通路通过以下几种机制发挥抗凋亡调节作用：①下调R-RAS信号通路，抑制细胞凋亡〔5〕；②Akt磷酸化凋亡前体蛋白BAD，抑制其促凋亡作用，并促进Bcl-2发挥抗凋亡作用③ARt通过激活NF-kB信号通路，促进细胞存活〔6〕；④通过下调p53蛋白表达，阻断P53介导的促凋亡转录反应；⑤诱导c-fos转录，发挥抗凋亡作用；⑥磷酸化forkhead蛋白，阻止其发挥调节凋亡相关基因转录功能〔7〕。研究发现，PI3K/AKT信号通路调节恶性肿瘤细胞的生长，侵袭转移凋亡和血管形成等，与肿瘤的发生和发展密切相关〔8～10〕，研究发现，P13K蛋白的高表达和Akt蛋白的高表达与宫颈癌细胞的增殖、浸润和转移有一定的相关性，但是，在宫颈癌的病理过程中，PI3K/Akt参与肿瘤细胞的凋亡过程尚不十分清楚〔11〕。

Bcl-2家族在调节线粒体途径中发挥了至关重要的作用，家族中的抗凋亡蛋白成员包括Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1等。促凋亡蛋白包括Bax、Bik、Bad和仅有BH3结构域的Bid、Bim、PUMA等BH3蛋白。这些蛋白多定位于细胞内的膜结构上，尤其是线粒体膜上。Bcl-2是线粒体凋亡通路中主要的调节蛋白， 其作用是抑制Caspase的激活底物， 如细胞色素C、凋亡诱导因子等从线粒体释放到细胞质，抑制细胞凋亡，其在肿瘤细胞的凋亡过程中发挥着重要作用。研究发现，在宫颈癌Hela细胞凋亡过程中，Bcl-2基因表达下降，同时伴随Bax、Bad等促凋亡基因表达的上调〔12～14〕，但是，在宫颈癌的病理过程中，PI3K/Akt能否通过调节Bcl-2的表达参与肿瘤细胞的凋亡过程尚需进一步研究。本研究结果提示上调Bcl-2的表达可能是PI3K/Akt信号通路调节宫颈癌的发生发展的重要环节之一。

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