蛹虫草小分子肽对百草枯致人胚肺成纤维细胞MRC-5过氧化损伤的保护作用

逄 利 王少坤 凡文博 张 楠 侯 玥 徐大海 吴 扬

(吉林大学第一医院急诊科，吉林 长春 130021)

百草枯中毒与氧自由基损伤、过度炎症反应、钙超载、酶失衡、细胞凋亡、DNA损伤及基因表达异常等有关〔1〕。蛹虫草小分子肽有抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化损伤等特点。本文旨在观察蛹虫草小分子肽对百草枯所致人胚肺成纤维细胞MRC-5过氧化的保护作用。

1 资料与方法

1.1实验材料及主要试剂 胎牛血清，人胚肺成纤维细胞MRC-5，DMEM培养基，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒。

1.2虫草小分子肽的提取 将购买的蛹虫草制成小分子肽，采用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定，小分子肽峰值分子量为300～700 D。

1.3MRC-5细胞的培养及分组 MRC-5细胞用0.25%胰酶消化后传代，计数后以106个/ml的密度悬浮于DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2条件下培养，连续培养4代后进行实验。将细胞随机分为5组：①对照组：MRC-5细胞常规培养；②模型组：加入终浓度为1 mmol/L的百草枯；③实验组1：加入终浓度为1 mmol/L的百草枯+5 mg/ml的蛹虫草小分子肽；④实验组2：加入终浓度为1 mmol/L的百草枯+10 mg/ml的蛹虫草小分子肽；⑤实验组3：加入终浓度为1 mmol/L的百草枯+20 mg/ml的蛹虫草小分子肽。

1.4MTT法测细胞存活率 细胞存活率用MTT 法测定〔2〕。

1.5检测方法 采用氯化硝基氮蓝四唑光还原法(NBT法)测定SOD活性，按照试剂盒说明操作，在560 nm处测定OD值。GSH-Px用DTNB显色法测定〔3〕。MDA含量用硫代巴比妥酸(TBARS)方法测定〔4〕。

2 结 果

2.1蛹虫草小分子肽对MRC-5存活率的作用 与对照组〔(46.13±7.56)%〕相比，百草枯可显著诱导MRC-5细胞的损伤，模型组细胞存活率仅为(17.06±3.43)%。随着蛹虫草小分子肽浓度增加，细胞的存活率也逐渐增加。较低浓度(5 mg/ml)的蛹虫草小分子肽〔(21.23±5.53)%〕与模型组相比没有明显的差别，而较高浓度(10、20 mg/ml)的蛹虫草小分子肽组对百草枯造成的损伤有显著地阻碍作用，细胞存活率分别为〔(26.78±5.69)%、(31.82±6.78)%〕(P<0.05)。

2.2蛹虫草小分子肽对MRC-5抗氧化酶系活性的影响 模型组SOD和GSH-Px的活性均明显低于对照组(P<0.05)。与模型组相比，SOD、GSH-Px的活性随蛹虫草小分子肽浓度的升高也相应提高，并存在明显的量效关系(P<0.05)。见表1。

2.3蛹虫草小分子肽对MRC-5细胞MDA含量的影响 随着蛹虫草小分子肽浓度增加，MDA含量逐渐下降。与模型组相比，中等浓度(10 mg/ml)和高浓度(20 mg/ml)蛹虫草小分子肽可使MDA显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组SOD、GSH-Px活性及MDA含量测定±s)

3 讨 论

本研究结果显示，蛹虫草小分子肽可保护细胞，能抑制百草枯诱导的细胞凋亡，并且其作用呈量效递增关系。

药效学实验证实蛹虫草对实验动物的多项免疫指标均有明显增强作用，可促进淋巴细胞转化，提高机体的细胞免疫功能；消除机体内超氧自由基；保护细胞膜稳定性及通透性；明显提高NK细胞的活性。虫草小分子肽为蛹虫草经过酶解工艺直接制得的蛹虫草水解物，主要作用包括减轻溶酶体损伤、稳定溶酶体；下调炎症基因和凋亡基因的表达；维持SOD，减少脂质过氧化产物MDA产生以及氧自由基所致的细胞损伤〔5，6〕。

总之，蛹虫草小分子肽可显著提高MRC-5细胞中SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，对百草枯诱导的MRC-5过氧化损伤具有明显的保护作用。

4 参考文献

1Dinis-Oliverira RJ，Duarte JA，Sanchez-Navarro A，etal.Paraquat poisonings：mechanisms of lung toxicity，clinical feature，and treatment〔J〕.Crit Rev Toxicol，2008；38(1)：13-71.

2贺 磊，李 曦，罗和生.葡萄糖对丁酸钠诱导的结肠癌细胞增殖抑制和凋亡效应的调节作用及其可能机制〔J〕.武汉大学学报：医学版，2008；29 (6)：732-5.

3Socha K，Kochanowicz J，Karpinska EB，etal.Dietary habits and selenium，glutathione peroxidase and total antioxidant status in the serum of patients with relapsing-remitting multiple sclerosis〔J〕.Nutr J，2014；13(1)：62.

4彭 燕，刘亚丽，孙晓丽，等.次血红素六肽保护心肌线粒体抗氧化损伤作用研究〔J〕.中国实验诊断学，2013；17(11)：1952-5.

5Li Y，Xue WJ，Tian PX，etal.Clinical application of Cordyceps sinensis on immunosuppressive therapy in renal transplantation〔J〕.Transplant Proc，2009；41(5)：1565-9.

6Buenz EJ，Bauer BA，Osmundson TW，etal.The traditional Chinese medicine Cordyceps sinensis and its effects on apoptotic homeostasis〔J〕.J Ethnopharmacol，2005；96(1-2)：19-29.