白藜芦醇对糖尿病肾病大鼠肾功能的保护作用及机制

李春花 周 磊

(吉林省人民医院内分泌科，吉林 长春 130021)

糖尿病肾病(DN)已经超过高血压肾病成为我国终末期肾病的第二位病因〔1〕。目前现有的临床治疗方法难以完全阻断DN进展，因此迫切需要深入研究其机制以开发新的治疗方法。白藜芦醇是一种从植物中提取的多酚醇类物质，是沉默信息调节子(SIRT)1的天然激活剂。现有大量研究证明，其对糖尿病的多种并发症具有良好的治疗作用，但机制尚不完全清楚〔2〕。SIRT1作为三级组蛋白去乙酰化酶，其活性变化可影响线粒体代谢和功能〔3〕。本研究观察白藜芦醇干预后DN大鼠肾组织中线粒体分裂、融合基因转录水平变化和线粒体膜电势变化，探讨其对肾脏的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康雄性Wistar大鼠45只，体重(200±20)g。随机分为对照组、DN组和白藜芦醇治疗组(RSV组)各15只。

1.2试剂与仪器 RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自美国Promega公司，PCR试剂盒购自北京天根公司，白藜芦醇购自美国Sigma公司，组织线粒体提取试剂盒购自美国Thermo公司，线粒体膜电势检测试剂盒JC-1购自上海碧云天生物技术有限公司，全自动生化分析仪为日本Olympus公司产品。

1.3建立DN大鼠模型 参考文献〔4〕进行少量修改，建立2型DN大鼠模型。健康Wistar大鼠，高脂饮食，腹腔一次性注射链脲佐菌素(STZ)50 mg/kg建立2型糖尿病模型(空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖++以上)，继续喂养12 w，根据血尿生化学检测、组织形态学检测，确立DN大鼠模型建立成功。

1.4给药方法 对照组和DN组生理盐水5 ml·kg-1·d-1灌胃。RSV组白藜芦醇20 mg·kg-1·d-1灌胃。均连续给药12 w，于治疗结束后，收集24 h尿标本，腹腔麻醉，取血标本和肾组织标本。

1.5检测指标 生化分析法检测血糖，酶联免疫法测定24 h尿白蛋白排泄率，肌酐清除率。

1.6线粒体分裂、融合基因转录水平表达变化 提取大鼠肾组织总RNA，分光光度计测定RNA质量和浓度。实时多聚酶链反应(RT-PCR)法检测线粒体融合基因Mfn1、Mfn2和线粒体分裂基因Fis1、Drp1 mRNA表达变化。引物及PCR反应条件见参考文献〔5〕。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，天能凝胶成像系统成像保存。

1.7线粒体膜电势检测 按照线粒体提取试剂盒说明书，从新鲜肾组织中提取完整线粒体，用线粒体膜电势检测试剂盒(JC-1)染色线粒体，流式细胞仪最大激发波长为514 nm，最大发射波长为529 nm检测。

1.8统计学处理 采用SPSS16.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组空腹血糖的比较 对照组空腹血糖(5.13±0.62)mmol/L，DN组(24.55±2.16)mmol/L,RSV组(21.74±5.34)mmol/L。DN组和RSV组血糖无明显差异(P>0.05)。

2.2各组肌酐清除率和24 h尿白蛋白的比较 对照组肌酐清除率(0.13±0.02)ml·min-1·100 g-1，DN组(0.37±0.07)ml·min-1·100 g-1，RSV组(0.19±0.05)ml·min-1·100 g-1。与DN组相比，RSV组明显降低(P<0.05)。对照组24 h尿白蛋白(1.93±0.42)mg/24 h，DN组(15.12±3.47)mg/24 h，RSV组(7.04±2.32)mg/24 h。与DN组相比，RSV组明显降低(P<0.05)。

2.3各组肾脏组织中线粒体动态变化平衡的影响 与对照组相比，线粒体融合基因Mfn1、Mfn2和线粒体分裂基因Fis1、Drp1在DN组均有不同程度增高，但其中Mfn2表达变化不明显。与DN组相比，RSV组Mfn1、Fis1降低明显(P<0.05)，而Drp1虽有所降低，但程度变化较小(见表1和图1)。

表1 3组Mfn1、Mfn2、Fis1、Drp1mRNA表达的密度扫描(n=3,±s)

图1 各组Mfn1、Mfn2、Fis1和Drp1的RT-PCR结果

2.4各组肾脏组织中线粒体膜电势的影响 与对照组(100.0%)相比，DN组、RSV组线粒体膜电势均有降低(P<0.05)。与DN组(60.24%±7.11%)相比，RSV组(83.04%±9.17%)明显增高(P<0.05)。

3 讨 论

糖尿病是慢性代谢性疾病，其发病率在全世界范围内呈持续增长势头。糖尿病患者长期的高血糖状态是促进血管病变和功能障碍的根本因素，引起多种糖尿病并发症，是糖尿病患者主要的致残致死原因。老年患者是慢性代谢性疾病和心血管疾病的高发人群。在临床治疗中，血糖稳态控制的困难及肾素-血管紧张素系统抑制剂治疗难以完全阻断肾病进展。SIRT1作为代谢相关疾病治疗研究的热点，其在肾脏活化可能成为新的治疗靶点，以抵抗多种因素导致的肾脏疾病包括DN的发生发展〔3〕。本文结果表明白藜芦醇具有明显的肾脏保护作用。

细胞内SIRT1活性受代谢和环境因素的影响。热量限制、饥饿、氧化应激和DNA损伤等都可诱导SIRT1表达增加，而高脂饮食、胰岛素抵抗、高血糖、老化则引起SIRT1表达降低。SIRT1去乙酰化底物是细胞代谢、能量消耗、炎症和应激反应通路的中心调节因子〔6〕。如SIRT1可通过去乙酰化赖氨酸残基激活过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子(PGC)1α，增高线粒体生物能量合成〔7〕。葡萄糖是维持烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型/还原型(NAD+/NADH)稳态的关键代谢底物，高血糖会通过影响重要代谢途径降低胞质NAD+/NADH比率，从而影响SIRT1活性。综上所述，高血糖状态可影响SIRT1活性和线粒体功能，而SIRT1、线粒体功能均在糖尿病及其并发症的发病机制中具有重要作用。

线粒体的动态变化包括线粒体分裂过程和线粒体融合过程。线粒体分裂、融合过程的平衡对于维持线粒体正常的形态、分布和功能十分重要〔8〕。本文表明线粒体的动态平衡在DN过程中发生变化。白藜芦醇能明显提高DN大鼠肾组织线粒体功能。白藜芦醇可通过活化SIRT1从而影响线粒体动态平衡和功能发挥对DN大鼠肾脏功能的保护作用。

4 参考文献

1侯振江，牟兆新，周秀艳，等. 尿微量白蛋白在糖尿病和高血压肾病早期诊断中的应用〔J〕. 中国实验诊断学,2010;14(9): 1389-92.

2Kume S,Thomas MC，Koya D.Nutrient sensing,autophagy,and diabetic nephropathy〔J〕. Diabetes,2012;61(1):23-9.

3Kitada M,Kume S,Takeda-Watanabe A,etal.Sirtuins and renal diseases: relationship with aging and diabetic nephropathy〔J〕.Clin Sci (Lond),2013;124(3):153-64.

4傅松波,汤旭磊,贾丽云,等.苦参碱对糖尿病大鼠肾脏的保护作用〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(3):376-8.

5Jendrach M,Mai S,Pohl S,etal. Short and long-term alterations of mitochondrial morphology,dynamics and mtDNA after transient oxidative stress〔J〕. Mitochondrion,2008;8: 293-304.

6Moscat J,Diaz-Meco MT.Feedback on fat: p62-mTORC1-autophagy connections〔J〕. Cell,2011;147(4): 724-7.

7Nakahira K,Haspel JA,Rathinam VA,etal.Autophagy proteins regulate innate immune responses by inhibiting the release of mitochondrial DNA mediated by the NALP3 inflammasome〔J〕. Nat Immunol,2011;12(3): 222-30.

8Lavu S,Boss O,Elliott PJ,etal.Sirtuins-novel therapeutic targets to treat age-associated diseases〔J〕. Nat Rev Drug Discov,2008;7(10): 841-3.