“温阳补气”针法对EAMG大鼠神经肌肉接头处乙酰胆碱受体表达的影响

王宇峰 张立娜 王洪峰

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

重症肌无力(MG)是一种以神经肌肉接头(NMJ)处传递功能障碍为主要病理改变的获得性自身免疫性疾病，主要由于NMJ突触后膜上乙酰胆碱受体(AchR)受损引起。其主要临床表现为部分或全身骨骼肌无力和极易疲劳，活动后症状加重，经休息和胆碱酯酶抑制剂(ChEI)治疗后症状减轻〔1〕。中医学认为MG属于“痿证”的范畴，患者以脾气虚弱、肾阳不足为主要病机，笔者以温阳补气为主要治疗原则，采用针灸疗法治疗本病取得了良好的临床疗效。为进一步研究“温阳补气”针法治疗MG的作用机制，本研究采用国际公认的免疫接种法建立实验性自身免疫性MG(EAMG)大鼠动物模型，观察该针法对EAMG大鼠NMJ处AchR表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF三级Lewis大鼠80只，雌性，6～8 w龄，平均体质量(154±7.4)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号码：SCXK(沪)2007-0005，检疫后送至长春中医药大学实验动物中心，标准大鼠颗粒饲料喂养。

1.2主要试剂和仪器 AchRα1 129-145多肽片段(美国Sigma公司)，大鼠AchR-Ab、AchR ELISA 检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司)，溴吡斯的明(60 mg/片，上海三维制药有限公司)，艾绒(南阳绿莹艾草生物制品有限公司)。

1.3大鼠EAMG模型建立方法 选取SPF级Lewis大鼠70只，采用免疫接种法建立EAMG大鼠动物模型。将AchRα1 129～145多肽片段按照1∶2的比例与CFA完全乳化，配比按照200 μl溶液内含有50 μg片段，不足部分用pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)定容至20 ml，充分混匀制成免疫乳剂，取一滴乳剂滴入水中呈现球形而不分散为乳化好的标志。首次免疫接种时，将上述抗原乳剂以300 μl/只(含AchRα1 129～145∶75 μg)多点注射于大鼠四只足垫部、尾根部、背部。在首次免疫后第4和8周，分别进行强化免疫接种，将AchRα1 129～145多肽片段以1∶2的比例与IFA完全乳化，配比按照200 μl溶液含有50 μg片段，不足部分用PH7.4的PBS液定容至20 ml，以200 μl/只(含AchRα1 129-145：50μg)多点注射于大鼠四只足垫部、尾根部、背部。以Lennon分级评分≥1分〔2〕，同时AchR-ab为阳性为EAMG大鼠模型造模成功标准。

1.4分组及治疗方法 选取建模成功的EAMG大鼠30只，随机分为针灸治疗组、药物对照组和模型对照组，每组10只，选取同期购进未建模的SPF级Lewis大鼠10只设为空白对照组。针灸治疗组予以“温阳补气”针法治疗，手三里(双)直刺5 mm，足三里(双)直刺6 mm，脾俞(双)直刺6 mm，肾俞(双)直刺6 mm，平补平泻，针上加灸，30 min/次，1次/d，7 d为一疗程，疗程间休息1 d，连续治疗2个疗程。药物对照组予以溴吡斯的明灌胃治疗，18.5 mg/kg/d，连续治疗15 d。模型对照组和空白对照组大鼠不予特殊处置，同等条件下饲养，每日抓取1次，观察一般情况。

1.5检测指标及方法 大鼠NMJ处AchR表达水平的检测：取大鼠下肢腓肠肌，立即用Warring 肌肉均浆器4℃搅拌制备匀浆，30 s/次，间隔15壁s搅拌1次，共搅拌3次；加入PBS不敷出10 ml，其中含0.4 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.4 mmol/L叠氮钠、0.004 mmol/L苯甲基磺酰氟和2%碘化乙酰胺；然后离心12 000 r/min，4℃，30 min。取上清液，用含2%TritonX2100的PBS 15 ml重悬，再次离心。取250 μl上清液(粗提AchR) 加2 nmol/L 125I-aBT和鼠抗AchR IgG，4℃包被24 h，然后加羊抗鼠血清4℃，4 h后离心洗涤于r 计数仪中计数，将标本放于-20℃条件下保存，检测前在室温下均匀解冻。之后采用ELISA法测定EAMG大鼠神经肌肉接头处AchR的含量，具体方法按说明书操作。

1.6统计学方法 应用SPSS19.0软件行t检验。

2 结 果

表1可见，EAMG大鼠动物模型造模成功后，模型对照组EAMG大鼠神经肌肉接头处AchR表达水平显著降低，与空白对照组比较具有极显著性差异(P<0.01)，证明AchR在EAMG的发病过程中发挥了重要的作用；经治疗后，针灸治疗组和药物对照组EAMG大鼠AchR的表达水平均明显提高，与模型对照组相比均具有显著性差异(P<0.01)，证明“温阳补气”针法和溴吡斯的明对EAMG大鼠经肌肉接头处AchR的表达水平均具有较好的调整作用；针灸治疗组与药物对照组相比无显著性差异(P>0.05)，说明“温阳补气”针法与溴吡斯的明对EAMG的治疗效果相近。

表1 各组大鼠腓肠肌神经肌肉接头处AchR表达水平±s,pg/μl)

3 讨 论

AchR-ab与NMJ突触后膜的AchR特异性结合，加速AchR的降解，导致突出后膜上AchR数量减少，阻碍了神经电信号的传导是MG产生的主要原因〔3,4〕。国内学者关兵峰等〔5〕研究显示，MG患者的胸腺瘤组织中烟碱型AchR(nAchR)蛋白表达低于胸腺增生组织；胸腺萎缩组织中nAChR蛋白的表达也低于正常对照组。陆天宇等〔6〕通过AChR亚基在老年MG患者中的表达中发现，胸腺瘤及胸腺中可以检测到AChR的5个各亚单位，胸腺瘤中AChR各亚单位灰度值/内参灰度值均低于肌肉组织，MG肌肉AChR亚单位中除γ亚单位外，均高于正常肌肉亚单位，上述研究结论均证明AchR的表达水平增高与MG的发病存在着密切的联系。

国内中医学专家〔7～9〕认为MG患者多以虚证为主，其病位主要在脾肾二脏，其病机主要为脾胃虚弱致气血化生乏源，或肾阳不足至精血亏虚，以致筋肉失于濡养，久之导致机体颓痿无力。“温阳补气”针法根据MG患者脾气虚弱，肾阳不足的主要病机，取手阳明经穴之手三里，取足阳明经穴之足三里，坚持了“治痿独取阳明”的治疗原则；同时，脾为“后天之本”、“气血生化之源”，肾为“先天之本”，故取脾俞、肾俞两穴，通过温补“先天之本”，健运“后天之本”，以调节脾肾二脏之虚弱不足，达到了温阳补髓、益气养血、濡润宗筋，补气助力、壮肌治痿的治疗目的。课题组通过前期的研究工作证实〔10〕，“温阳补气”针法可以通过调节EAMG大鼠血清中转化生长因子(TGF)-β、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达水平而发挥治疗作用。通过本研究可进一步发现：“温阳补气”针法可以促进EAMG大鼠NMJ处AchR表达水平的增高，增加NMJ突出后膜上AchR的数量，促进神经电信号的传导，从而达到治疗MG的作用。

4 参考文献

1Jayam TA,Dabi A,Solieman N,etal. Myasthenia gravis: a review 〔J〕. Autoimmune Dis,2012;2012:874680.

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3Le Panse R,Berrih-Aknin S. Autoimmune myasthenia gravis: autoantibody mechanisms and new developments on immune regulation 〔J〕. Curr Opin Neurol,2013；26(5): 569-76.

4Shen C,Lu Y,Zhang B,etal. Antibodies against low-density lipoprotein receptor-related protein 4 induce myasthenia gravis 〔J〕. J Clin Invest,2013;123(12): 5190-202.

5关兵峰,崔新征,方 华,等.重症肌无力患者胸腺组织中胆碱乙酰转移酶和烟碱型乙酰胆碱受体的表达〔J〕.郑州大学学报:医学版,2012;47(3): 299-302.

6陆天宇,王泳心,崔有斌.乙酰胆碱受体亚基在老年重症肌无力合并胸腺瘤患者中的表达〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(8): 1785-7.

7邓中广,邱仕君.邓铁涛对重症肌无力的认识与辨证论治〔J〕.中国医药学报,1993;8(2): 41-23.

8王 珏.裘昌林治疗重症肌无力的经验〔J〕. 浙江中医杂志,2004;39(6):238-9.

9周俊亮.刘友章教授诊治重症肌无力的临床经验介绍〔J〕.现代中西医结合杂志,2004;13(23):3107-8.

10王洪峰,吴 瑶,张立娜.“温阳补气”针法对EAMG大鼠血清TGF-β和TNF-α水平的影响〔J〕.中国老年学杂志,2013；33(23):5884-5.