紫草萘醌组分抑制移植性肝癌新生血管的形成

闫光志 艾郁葱 刘力华

(吉林省肿瘤医院，吉林 长春 130012)

紫草为中国药典收载的传统中草药。萘醌类色素为其主要有效成分；具有抗炎、抗肿瘤、保肝和免疫调节、抗病毒等作用〔1〕。本研究旨在探究紫草萘醌类化合物抑制肿瘤新生血管形成的作用。

1 材料与方法

1.1动物 50只雄性昆明小鼠购于吉林大学动物部。

1.2试剂 凝血第Ⅷ因子相关抗原(FⅧRAg)和平滑肌肌动蛋白α (α-SMA)单克隆抗体均为DAKO公司产品。紫草萘醌类提取物由吉林省肿瘤防治研究所提取制备成为水溶制剂(命名LE)。紫草素含量与标准品对比，用RPMI1640培养液配制为所需浓度。

1.3肿瘤体积测量 将50只小鼠随机分为五组,每组10只。每只小鼠的左腋窝皮下注射肝癌细胞株(Hep-A-22)细胞。皮下接种肿瘤24 h后开始给药。阳性对照组5-氟尿嘧啶(5-FU)腹腔注射，20 mg/kg；微乳液(LE)灌胃，剂量2.5、5.0和10.0 mg/kg。阴性对照组予以相同容积的溶剂灌胃，连用7 d。次日处死小鼠手术剥离取出肿瘤结节并称量瘤体重量。实验重复3次。

1.4微血管密度(MVD)测定 采用LSAB免疫组织化学染色。FⅧRAg和α-SMA单克隆抗体的工作浓度是1∶300。结果以在肿瘤血管内皮细胞和周细胞胞质出现棕黄色颗粒判定为阳性。α-SMA染色的组织切片中,首先在100倍视野下随机选择血管密度高5个区和血管密度低5个区作为计数部位,最后在400倍视野下对应计数血管个数及胞质出现棕黄色颗粒的血管周细胞数,残存血管不做计数,然后计算单位视野(400倍)平均血管数,即间质MVD。MVD的计算按Weidner报道的方法进行:先在40倍光镜下找到癌巢周围间质血管密集区,然后在200倍的光镜下计数上述4个不同区域的血管数,取其平均值为血管密度。

1.5统计学方法 两组肿瘤体积及MVD的比较应用t检验;VEGF的表达应用Ridit检验 。

2 结 果

2.1LE抑制Hep-A-22体内增殖 LE对可移植性肝癌的体内增殖具有抑制作用，三次实验结果显示皮下肿瘤的体积均明显小于阴性对照组(P<0.01)。见表1。

2.2LE抑制肿瘤组织新生血管形成 皮下接种Hep-A-22 7 d后，免疫组化染色肿瘤组织的微血管。血小板FⅧRAg的免疫组化染色结果可见阴性对照组肿瘤组织中有大量新生微小血管形成。LE给药小鼠皮下肿瘤体积小，FⅧRAg免疫组化染色显示阳性微血管明显稀少，提示对新生血管形成的抑制作用。见图1。

表1 LE抑制肿瘤Hep-A-22的体内增殖及对新生血管形成的影响

图1 肿瘤新生血管形成及LE的抑制作用(×100)

2.3肿瘤新生血管分析 如表1所以，应用LE或5-FU，肿瘤体积明显比对照组小，5-FU的抑制率高达50%。LE的抑瘤作用呈剂量依赖关系，差异显著(P<0.05)。LE的最小剂量即2.5 mg·kg-1·d-1和5-FU给药对肿瘤组织MVD表现相近程度的下调作用，均超过50%。而LE 10.0 mg/kg的MVD抑制超过70%，说明LE与5-FU都降低肿瘤组织的MVD；而LE的此种作用更为明显。因此，新生血管形成的抑制是LE体内抑制Hep-A22肿瘤生长的重要原因。

3 讨 论

LE抗肿瘤机制研究多集中在其诱导凋亡方面〔2～6〕,而对肿瘤体内血管生成的报告较少〔7〕。由于肝癌血管结构特殊,血供丰富,抑制肿瘤血管生成对治疗肝癌更具有重要意义。肿瘤的MVD被认为是能反映肿瘤血管生成的一个指标,它不仅与肿瘤细胞的营养和供氧有关,而且也反映肿瘤的浸润和转移能力。肿瘤血管的启动是由肿瘤细胞分泌的促内皮细胞增殖和迁移的多种生长因子所诱发,如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子α(PDGFα)等,其中以VEGF及bFGF在实体瘤的生长和转移中起重要作用。在众多研究中,VEGF已被认为与肿瘤的浸润转移有关,抑制VEGF的活性或减少其受体(KDR)均能明显抑制实验性肿瘤的生长和转移。

Folkman等〔8〕提出，肿瘤生长和转移依赖新生血管形成，经过近几十年研究，这一观点已被普遍接受，肿瘤与血管形成之间的相互作用机制也渐明确〔7〕。基于这一理论，抑制和破坏肿瘤新生血管阻断肿瘤血供，导致肿瘤细胞坏死和阻断转移，可能成为治疗肿瘤的新策略。肿瘤血管生成的机制不同于生理条件下血管生成，也不同于胚胎时期的血管生成。其特点既有癌细胞分裂增殖因素，也有局部炎症和新生血管形成的改变。本研究显示LE的最主要抗癌活性仍然是对癌细胞生长及其功能的抑制。这是因为最大给药剂量即10 mg·kg-1·d-1，肿瘤体积比对照低50%，而MVD的减少只有30%。这说明紫草萘醌类化合物对肿瘤细胞的直接抑制是导致瘤块膨胀减速的第一要素。而MVD的减少则是紫草萘醌类化合物的间接作用；减少肿瘤细胞VEGF的表达为其机制之一。事实上，新生血管形成的机制可能相当复杂。Furuya等〔9〕认为，脊椎动物胚胎发育和分化过程中，新生血管形成不可或缺。而对于成年人来说，许多生理或病理状态，例如创伤修复、代谢疾病、炎症、心脏血管疾病以及肿瘤进展都有新生血管形成参与。现在已经发展了一些与之相关的治疗技术，例如调节参与新生血管作用之细胞因子可以抑制肿瘤进展。这些治疗技术中，一部分已经进入临床前研究阶段。然而肿瘤新生血管形成过程非常复杂，不同肿瘤有其独特的表现。组织特异性、新生血管微环境以及肿瘤分化程度等因素都与之有关；甚至宿主免疫性都可能在肿瘤新生血管形成过程起一定作用。因此要想正确认识并掌握有关的治疗方法，不但需要了解新生血管形成的一般原理，而且需要了解各种疾病特异性的事件。后者涉及内皮性前体细胞、肿瘤血管模拟、瘤性来源内皮细胞和周细胞的分子标志以及血管形成相关的细胞因子等问题。不可否认，肿瘤细胞的旁分泌效应，例如本文检查的VEGF表达，在肿瘤新生血管形成过程中是非常重要的事件；而Furuya等〔9〕提到的宿主免疫性，即癌细胞微环境中的炎症反应对微血管形成也具有刺激作用。小鼠可移植性肝癌组织切片的免疫组化染色证明：LE不仅抑制肝癌细胞的原位生长，也抑制癌细胞分泌VEGF，从而明显抑制接种局部肝癌组织内新生微血管的形成。

4 参考文献

1黎玉红，周晓荣.新疆紫草的研究进展〔J〕.新疆中医药，2002；20(4)：75-7.

2黄 河，谢冰芬，朱孝峰，等.紫草素衍生物Syunz-7 的抗肿瘤作用及其机制的初步研究〔J〕.癌症，2005；24(12)：1453-8.

3Wu Z，Wu L，Li L，etal.p53-mediated cell cycle arrest and apoptosis induced by shikonin via a caspase-9-dependent mechanism in human malignant melanoma A375-s2 cells〔J〕.J Pharmacol Sci，2004；94(2):166-76.

4Kuiper RA，Schellens JH，Blijham GH,etal.Clinical research on anti geogenic therapy〔J〕.Pharmacol Res,1998；37(1):1-16.

5Folkman J,D′Amore PA.Blood vessel formation：what is its molecular basis〔J〕？Cell， 1996；87(7)：1153-5.

6Staniforth V,Wang SY，Shyur LF,etal.Shikonins phytocompounds from Lithospermum erythrothizon inhibit the transcriptional activation of human tumor necrosis factor alpha promoter in vivo〔J〕.J Biotl Chem,2004；279(7):5877-85.

7刘小平，宋少柏，徐文通，等.结直肠肿瘤微血管计数及血管内皮细胞生长因子表达〔J〕.中华肿瘤杂志，1999；21(6):430.

8Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent 〔J〕？J Natl Cancer Inst，1990；82(1):4-6.

9Furuya M，Nishiyama M，Kasuya Y,etal.Pathophysiology of tumor neovascularization〔J〕.Vasc Health Risk Manag，2005;1(4)：277-90.