糖蛋白Ibα基因VNTR多态性与冠心病的相关性

马 芳 刘晓妹 郝艳梅 张英杰 孙 红 吴俊英

(蚌埠医学院医学检验系临床检验诊断学教研室 临床检验诊断学实验中心，安徽 蚌埠 233030)

冠心病是动脉血栓形成性疾病中的一个典型代表，严重威胁着人类的健康和生命〔1〕。在血栓形成过程中，血小板的激活是关键，活化的血小板可表达和释放多种促凝和促炎的蛋白质参与炎症反应和血栓形成〔2,3〕。而在激活血小板过程中，血小板糖蛋白(GP)Ibα与血管性血友病因子(vWF)结合并相互作用起关键作用〔4〕。GPIbα的编码基因位于17p12，其巨糖肽区39 bp的可变数目串联重复序列(VNTR)多态性影响着GPIbα的结构和功能，可能与冠心病发病存在关联性。国内外关于GPIbα基因VNTR多态性与冠心病相关性的报道尚不多见，且由于地域不同、种族差异等因素，结论并不一致。本文采用病例-对照法结合分子生物学技术，首次探讨GPIbα基因VNTR多态性在我国皖北地区汉族人群中的分布频率及其与冠心病发病的关系。

1 对象与方法

1.1对象 2009 年1月至2011 年2 月蚌埠医学院第一附属医院心内科来自淮北、阜阳、亳州、蚌埠等地区的冠心病患者136 例，男94例，女42例，平均年龄(63.19±11.86)岁，均经冠状动脉造影确诊，以左、右冠状动脉及主要分支中任何1支血管直径狭窄程度≥50%为阳性〔5〕。对照组为年龄、性别与冠心病组匹配的同期门诊健康体检者，155 例，男104 例，女51 例，平均年龄(60.91±9.07)岁，两组年龄、性别、体质量指数(BMI)具有可比性，所有研究对象均知情同意，均为无血缘关系的皖北地区汉族人群，排除其他心脑血管疾病和严重肝肾疾病。本研究已征得院医学伦理委员会批准同意。见表1。

1.2方法

1.2.1资料收集 询问并记录所有研究对象的病史、家族史、吸烟和饮酒情况，测量身高、体质量和血压。空腹12 h以上测定总胆固醇(TC)、三酯甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和空腹血糖(FBS)等各项生化指标(OLYMPUS AU5400全自动生化分析仪)。

1.2.2基因组DNA制备 取研究对象的空腹肘前正中静脉血1.8 ml于枸橼酸钠抗凝的真空采血管中，采用人类全血基因组DNA抽提试剂盒(Takara公司)抽提DNA，以TE溶解DNA，紫外分光光度法测定其浓度，DNA样本置于-20℃贮存、备用。

1.2.3基因扩增 引物〔6〕由广州瑞真公司合成，P1：5′-TCCACTGCTTCTCTAGACAG-3′P2：5′GGCTGATCAAGTTCAGGGAT-3′，采用多聚酶链反应(PCR)试剂盒(MBI Fermentas公司)进行基因扩增。PCR反应总体积为25 μl：8.5 μl water free，12.5 μl 2×PCR Master Mix，0.1 μmol/L的上、下游引物各1 μl和DNA模板2 μl。扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，56℃退火50 s，72℃延伸1 min，共32个循环，最后1个循环延伸7 min。

1.2.4多态性检测 取PCR产物5～10 μl，溴乙锭(EB)染色后，点样于2%琼脂糖凝胶上，以100～600 bp DNA作为Marker(合肥博美公司)，电泳30 min，在凝胶成像仪下观察结果并照相，确定多态性基因型。

2 结 果

2.1两组危险因素对比 冠心病传统危险因素如高血压、高脂血症、糖尿病在两组的构成比有显著差异(P<0.05)。TG与LDL-C水平在两组之间无统计学差异，但冠心病组TC及HDL-C水平低于对照组。见表1。

表1 两组临床资料与危险因素对比

2.2PCR扩增产物分析 本研究中仅发现B和C两种等位基因及BC、BB、CC三种基因型，未发现含A、D等位基因的个体。见图1。

2.3两组VNTR各基因型及等位基因频率的比较 GPIbα VNTR各基因型在两组的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P> 0.05)，具有人群代表性。两组基因型分布和等位基因频率的差异均有显著差异(均P<0.001)，其中VNTR CC纯合子使皖北地区汉族人群冠心病发病的危险度明显提高，VNTR BC基因型携带者冠心病发病的危险度显著降低，VNTR C等位基因与该地区冠心病发病明显相关。见表2。

M: 100 bp DNA Marker; 1,5,6,7: BC; 2: BB; 3,4: CC

表2 冠心病组和对照组VNTR基因型及等位基因频率的比较〔n(%)〕

2.4不同冠状动脉病变支数VNTR基因型分布比较 冠状动脉不同病变支数患者的VNTR基因型构成无显著性差异(P=1.750，P= 0.941)。见表3。

表3 冠脉病变支数与VNTR基因型分布的相关性(n)

2.5VNTR基因型与传统危险因素交互作用对冠心病发病的影响 排除冠心病传统危险因素的影响，VNTR CC基因型仍为冠心病发病的一个独立危险因素，而BC基因型为冠心病发病的遗传保护因素。见表4。

表4 冠心病独立危险因素Logistic回归分析

3 讨 论

VNTR多态性是编码GPIbα巨糖肽区的39 bp重复4、3、2、1 次分别产生的A、B、C、D 4 种等位基因〔7〕。由于39 bp每重复1次Ibα蛋白质分子的长度就增加13 个氨基酸，使GPIbα氨基末端的vWF结合区远离血小板膜，将GPIbα分子暴露于更大的剪切变力而更易于同vWF结合并相互作用〔8〕，引起血小板胞浆内Ca2+浓度的升高，使GPⅡb/Ⅲa上的vWF受体也暴露并结合vWF，进而引起血小板聚集〔9〕。这可能是VNTR多态性影响GPIbα受体功能的主要原因，也是VNTR多态性影响动脉血栓形成性疾病发生的重要因素。

理论上VNTR多态性的4 种等位基因可产生10 种基因型，但在不同地区、不同种族，其分布状况有一定差异。在白人和非裔美国人中仅存在B、C、D 3 种等位基因及BB、BC、CC、CD、DD 5 种基因型〔10〕。日本健康人群的VNTR多态性表现为A(15.5%)、B(1.0%)、C(53.9%)、D(29.6%)〔11〕。中国东北地区汉族人群中仅存在B(0.67%)、C(69.5%)、D(29.83%)3 种等位基因和BC、BD、CC、CD、DD 5 种基因型〔12〕，Zhang等〔13〕在济南地区也未发现A等位基因。这些差异提示血小板GPIbα基因VNTR多态性具有地区或种族特点，是基因与环境相互作用的结果，也可能与样本的选择和数量有关。

GPIbα基因VNTR多态性与冠心病是否相关目前尚有较大的争议。Afshar-Kharghan等〔10〕认为，白人的VNTR基因型与冠心病的发生无明显相关性，而在非裔美国人中VNTR CC纯合子冠心病的发生率较低。与之相反，Douglas等〔14〕对高加索白人和印度人的研究结果显示VNTR CC是冠心病发病的危险因素。本研究结果表明VNTR多态性可能与皖北地区汉族人群冠心病的发病相关，但与冠脉病变的严重程度无明显关系。Ozelo等〔8〕发现巴西人心肌梗死患者中VNTR CD的频率是正常人的2 倍，而VNTR BC的频率则低于正常对照，这与本研究结果有相一致之处，提示VNTR BC可能是冠心病发病的保护因素。

综上，冠心病的发生、发展及对治疗的反应都与遗传和环境因素密切相关，探究与冠心病发病相关的遗传易感因素、确定高危人群，对冠心病的早期遗传学诊断和防治具有重要的现实意义。本研究样本量相对较小且病例组局限于皖北地区存活的冠心病患者，生存偏性不可避免，故GPIbα基因VNTR多态性与冠心病的确切关系尚待更大规模的前瞻性研究证实。

4 参考文献

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8Ozelo MC,Origa AF,Aranha FJ,etal. Platelet glycoprotein Ibalpha polymorphisms modulate the risk for myocardial infarction〔J〕. Thromb Haemost,2004；92(2):384-6.

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12辛晓敏，蒋丽鑫，王 瑶，等. 中国北方地区汉族人群血小板膜糖蛋白Ibα VNTR多态性的分布与脑梗死患者CC基因型与阿司匹林敏感相关性分析〔J〕. 中国实验诊断学,2012；16(3):481-3.

13Zhang Y,Wang Y,Wang Y,etal. Platelet glycoprotein polymorphisms: risk,in vivo expression and severity of atherothrombotic stroke in Chinese〔J〕. Clin Chim Acta,2007；378(1-2):99-104.

14Douglas H,Davies GJ,Michaelides K,etal. Detection of functional differences between different platelet membrane glycoprotein Ibalpha variable number tandem repeat and Kozak genotypes as shown by the PFA-100 system〔J〕. Heart,2006；92(5):676-8.