AnnexinⅡ在肝细胞癌中的表达及其临床意义

崔银星 孔 菲 高普均

(吉林大学第一医院肝胆胰内科，吉林 长春 130021)

原发性肝细胞癌作为严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率在我国呈逐年上升趋势〔1,2〕。肝细胞癌因其早期诊断、检查方法尚不完善，具有高复发率、高死亡率及预后差等特点，寻找肝细胞癌早期诊断的指标，提高患者早期诊断率，是当今研究的重点。钙磷脂结合蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ)是一类钙离子依赖性磷脂结合蛋白，参与细胞黏附、分泌、迁移、增殖和凋亡、细胞骨架连接等多种生理过程〔3～6〕，与肾细胞癌、胰腺癌、小细胞肺癌和脑星形细胞瘤等多种肿瘤的发生、发展密切相关〔7～10〕，但目前国内外尚缺少AnnexinⅡ在原发性肝细胞癌中的研究。本研究通过检测肝细胞癌中的组织和瘤旁组织中AnnexinⅡ表达情况，明确其在肝细胞癌表达情况及其临床意义。

1 资料与方法

1.1材料 选择2005～2007年韩国加图立大学首尔圣母医院手术切除的原发性肝细胞癌肿瘤组织和瘤旁组织18例，其中男10例(55.6%)，女8例(44.4%)，标本取出后立即放置在-80℃ 的冰箱中保存。79例肝癌石蜡组织标本选自韩国加图立大学首尔圣母医院病理库，其中男56例(70.9%)，女23例(29.1%)，年龄43～74〔平均(55±7.2)〕岁。所有患者术前均未接受放化疗，并签署知情同意。8例正常肝组织标本选自韩国法医鉴定中心提供的正常肝石蜡组织标本，其中男5例，女3例，年龄40～72〔平均(48±7.4)〕岁。本研究已获得韩国生命伦理审核委员会批准。

1.2实验试剂 研究使用的试剂主要包括：鼠抗人AnnexinⅡ单克隆抗体(Santa Cruz)，辣根过氧化物酶标记鹅抗鼠IgG(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ),鼠抗人β-actin单克隆抗体(Sigma)，Western印迹法蛋白定量试剂盒(PIERCE,USA)，标准蛋白参照物Marker(PIERCE,USA)，硝酸纤维素膜转印膜(Whatman,Maidstone,Kent,UK)，抗体稀释液(Gloden Bridge,Mukilteo,WA)，聚合物检测系统(Gloden Bridge,Mukilteo,WA)。

1.3Western印迹检测方法 从冰冻肝细胞癌和相应瘤旁肝组织标本中取0.2 cm左右大小的组织块，加入1 000 μl裂解液，冰浴下匀浆，静置5 h，4℃，13 000 r/min离心20 min，收集上清液。用考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白作为标准进行蛋白定量，计算各标本蛋白浓度，制作样本。提取样本经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰铵凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后，转印至硝酸纤维素膜(100 V,90 min)，50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，经Tris盐酸缓冲液(TBST)(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，0.5 ml/L Tween-20)冲洗3次，鼠抗人AnnexinⅡ单克隆抗体(1∶500)4℃孵育过夜后，弃去一抗，TBST洗膜3次，加入二抗37℃孵育2 h，TBST洗3次，用显色试剂(ECL)覆盖膜后，用MultiGaugeV3.0图像分析软件显像并测定各样本显色的灰度，利用灰度值进行比较，以β-actin作为内对照。

1.4免疫组织化学染色方法 以4 μm厚度切片，65℃温箱烤片30 min，常规脱蜡水化后,用pH6.0的柠檬酸钠缓冲液微波修复，滴加由抗体稀释液稀释至1∶1 000的一抗4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，滴加酶标二抗，37℃孵育1 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染细胞核，常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，以人宫颈癌肿瘤组织作为阳性对照。每一张切片在200倍视野中采集5个视野，统计阳性细胞在每个视野中所占的比例，阳性率=阳性细胞数/癌细胞总数×100%，5个视野的阳性率平均值即为该张切片的阳性表达水平，≥10%以上为阳性，反之为阴性。

2 结 果

2.1肝细胞癌和瘤旁组织Western 印迹检测 18例肿瘤组织及瘤旁组织Western 印迹电泳结果显示肝细胞癌和瘤旁肝组织中AnnexinⅡ均有表达，其中13例(72.2%)患者肿瘤组织条带灰度高于瘤旁组织，另外5例(27.8%)患者肿瘤组织条带灰度低于瘤旁组织，肝细胞癌肿瘤组织条带灰度值明显高于瘤旁组织(P=0.03)。见图1。

2.2免疫组织化学 AnnexinⅡ主要表达与肿瘤组织和瘤旁组织肝细胞质中，细胞膜及细胞核中表达不明显。79例配对原发性肝细胞癌肿瘤组织表达阳性率明显高于瘤旁组织(46.8% vs 25.3%，P=0.005)，8例正常肝组织中表达均为阴性，肿瘤组织表达阳性率明显高于正常肝组织(P=0.019)，瘤旁组织和正常肝组织表达阳性率无显著差异(P=0.189)。肿瘤组织中AnnexinⅡ在不同性别、年龄表达阳性率无显著性差异(均P>0.05)。肿瘤组织中AnnexinⅡ表达阳性率与肿瘤组织分化程度和病理分级无关(均P>0.05)。见表1，图2。

NT:癌旁组织，T：肝细胞癌肿瘤组织

表1 肿瘤组织及瘤旁组织中AnnexinⅡ表达与临床病理特征关系〔n(%)〕

A：肝细胞癌组织阳性染色;B:瘤旁组织阳性染色;C:瘤旁组织阴性染色

3 讨 论

癌症的发生发展是多基因多因素参与的复杂过程，原发性肝细胞癌属于恶性肿瘤，在临床病例中，肝癌发病率较高，仅次于胃癌和肺癌〔1,2〕，我国近年来的肝癌患者在不断地增加，给患者带来了巨大的身心痛苦。肝细胞癌的发病机制尚未明确，临床对肝癌的研究一直在进行，到目前为止也已经取得了一定进步，但是对于肝癌的早期诊断，还缺乏非常明确的标准，研究肝细胞癌及瘤旁组织表达差异性，可以在一定程度上对肝癌的发生发展、诊断和治疗提供一定的参考依据。

以往的研究〔3～6〕已证明AnnexinⅡ对生命活动发挥着很大的作用，Dreier等〔11〕通过免疫组织化学染色对人类正常组织中AnnexinⅡ的表达情况进行分析。AnnexinⅡ在胸腺小体、胰腺外分泌细胞、肾盂、膀胱上皮细胞等细胞内高表达；在唾液腺、贲门及胃体上皮细胞、 腺垂体、蛛网膜及脂肪组织等中表达较低。AnnexinⅡ在多数肿瘤中表达高于正常组织〔7～10〕，但在前列腺癌中为低表达或表达缺如，考虑与AnnexinⅡ基因的甲基化及磷酸化有关〔12,13〕。AnnexinⅡ在肝癌中的表达相关报道较少，1990年美国学者Frohlie等〔14〕首次报道AnnexinⅡ在肝癌中的表达明显高于正常肝组织。

本研究AnnexinⅡ在肝细胞癌中表达水平增高，与以往研究结果相一致〔15〕。AnnexinⅡ在肿瘤组织表达高于瘤旁组织及正常肝组织，提示AnnexinⅡ参与肿瘤形成，待进一步扩大样本量验证，其可能成为肝细胞癌新的诊断靶点。

肿瘤组织中AnnexinⅡ表达阳性率与肿瘤组织分化程度和病理分级无关，这可能与此次实验样本例数少有关。AnnexinⅡ在低分化的肝细胞癌及病理分级Ⅱ～Ⅲ级中有阳性表达率增高的趋势，提示AnnexinⅡ阳性率的增高可能与肿瘤的转移能力增强和恶化程度有关。

侵袭性转移是肝癌患者预后差的主要原因之一〔16〕，因此研究延缓或阻止侵袭性转移是肝癌治疗中的一大难题，而曾有研究表明，在肿瘤细胞中，AnnexinⅡ升高可增加纤溶酶及前组织蛋白酶B的生成，促进蛋白水解级联反应，降解细胞外基质蛋白，从而促进肿瘤的脱落与转移〔17〕。这对于早期诊断和治疗均有较强的参考性，AnnexinⅡ的表达对肝细胞癌的发生、发展及预后等方面的内容则还需要进一步的深入研究。

4 参考文献

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