人参皂苷Rb3保护低糖低氧/复氧诱导乳鼠皮层神经元凋亡的离子通道机制

王巧云 刘 凤 李金莲 杨 静

(滨州医学院基础学院，山东 烟台 264003)

人参皂苷Rb3是五加科植物人参、西洋参、三七等的主要药理活性成分，主要存在于人参的根、花蕾、茎叶和西洋参的根、茎叶以及三七的茎叶中。现代科学研究发现人参皂苷Rb3可显著保护脑缺氧缺糖导致的缺血损伤，机制可能保护线粒体功能、拮抗钙离子、抑制细胞凋亡及caspase活性有关〔1，2〕。目前，mitoKATPC通道在心脑保护中的地位已引起广泛关注，也有研究报道三七总皂苷(Rb3为主要成分之一)对心肌缺血再灌注损伤的保护作用与mitoKATPC开放有关。mitoKATPC是否也参与人参皂苷Rb3抗脑缺血缺性损伤的凋亡作用，尚未见报道。本研究以OGD/R皮层神经细胞为研究对象，观察人参皂苷Rb3的抗凋亡作用及离子通道机制。

1 材料与方法

1.1实验药物 人参皂苷Rb3 (南京泽朗医药科技有限公司，纯度为98%，批号： ZL201003)。

1.2动物 新生24 h Wistar大鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所，合格证号：SCKX(京)2004-0001。

1.3试剂与仪器 MEM/F12培养基，购自Gibco公司；胰蛋白酶、Hochest 33342、5-HD，均购自Sigma公司；标准胎牛血清(FBS)、马血清为Hyclone产品；兔抗大鼠 MAP-2抗体、罗丹明标记的羊抗兔 IgG二抗由北京中杉试剂公司提供；兔抗PARP 为Santa Cruz 产品；Caspase-3活性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；其他为国产分析纯。倒置相差显微镜(OLYMPUS-IX71)，细胞培养箱(日本三洋公司)，Spectra Max M5 酶标仪(Molecular Devices 公司)，低温离心机(德国Beckman 公司)。

1.4方法

1.4.1大鼠皮层神经元的原代体外培养及鉴定〔3，4〕

1.4.1.1包被培养板 细胞培养前2 h，用0.1‰多聚赖氨酸(PLL)包被24孔培养板，置5% CO2培养箱中，使用前用D-Hank′s液冲洗干净。

1.4.1.2皮层的分离 取新生1 d的Wistar乳鼠，75%乙醇皮肤消毒后，剥离皮肤及颅骨，暴露并取出完整的脑组织，解剖显微镜下去除血管、脑膜及海马，分离出皮层组织。

1.4.1.3消化 用眼科剪将皮层组织剪成直径为1 3 mm3的小块，剪碎后移入无菌离心管中。加入0.125%的胰蛋白酶4 ml， 37℃消化约20 min。然后以完全培养基终止消化，离心(1 000 r/min)10 min。

1.4.1.4细胞收集 弃去上清液，加入DMEM完全培养液3～5 ml，以吸管轻轻吹打细胞至细胞分散，然后经200目筛网过滤收集细胞。

1.4.1.5细胞计数 取样，用计数器进行细胞计数，调整细胞浓度为106/L。接种1.0 ml/孔 于24孔培养板中，置5% CO2培养箱中，37℃培养。24 h后换液，以除去悬浮死亡的细胞。于接种的第3天，吸去培养基，加入终浓度为3 μmol/L的阿糖胞苷24 h(每孔1 ml)，以抑制非神经元生长。以后每周换液2次，每次换半液，定时在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况，并进行显微摄影。培养置10～12 d开始试验。

1.4.1.6大鼠皮层神经细胞的鉴定-微管相关蛋白2(MAP-2)荧光染色检测 细胞培养第 10 天进行免疫细胞荧光染色检测，以证实其性质及纯度。过程如下：将培养液弃去，以 0.01 mol/L的PBS (pH 7.4，37℃)洗涤三次，4% 多聚甲醛室温固定 20 min，0.3% Triton X-100 作用 15 min 将细胞穿孔，再由 PBS 孵育 3×3 min，吸弃 PBS，滴加一滴 10% 羊血清，孵育10 min后弃去，各孔加入兔抗大鼠 MAP-2抗体(1∶400)，4℃过夜，次日 PBS 冲洗后(3×10 min)，滴加第二抗体-罗丹明标记的羊抗兔 IgG(1∶800)，常温孵育2 h，孵育结束前 20 min 加入2 μg/ml的Hoechest 33342。由 PBS 冲洗 4×10 min，吹干后立即由缓冲甘油封固，置荧光显微镜下观察表达阳性的细胞，每孔随机取6个视野，记录3孔，计算阳性细胞数。

1.4.2原代神经元低糖低氧/复氧模型建立〔5〕制备模型前以无糖Earle′s平衡盐缓冲液冲洗4次，每次为原完全培养基体积的2/3，使葡萄糖终浓度小于1 mmol/L。每孔加入100 μl 终浓度为10 mmol/L Na2S2O4无糖Earle液，于CO2培养箱中孵育2 h，取出并吸弃平衡盐缓冲液，换以完全培养基，再置入CO2培养箱孵育24 h。

1.4.3实验分组及给药 将以上培养的细胞分为6组：正常对照组：正常换液培养；在制备OGD模型时同步换以含糖Earle液。低糖低氧再灌注损伤组(OGD/R)：终浓度为10 mmol/L Na2S2O4无糖Earle液，于CO2培养箱中孵育2 h，取出并吸弃平衡盐缓冲液，换以完全培养基，再置入CO2培养箱孵育24 h，模拟体内缺血再灌注的过程。人参皂苷Rb3组、5-HD组：换以完全培养基后，分别加60 mol/L人参皂苷Rb3、5-HD，作用30 min后行OGD/R损伤。60 mol/LRb3+5-HD组：人参皂苷Rb3作用15 min后，加入5-HD，15 min后行OGD/R。

1.4.4荧光素染料Hoechst33342测定皮层神经元凋亡 模型制备结束，吸除培养液， PBS 清洗三次，加入染色液(Hoechst 33342/DMEM，5 μmol/L)，37℃、5% CO2培养箱避光染色10 min，无血清无酚红培养剂清洗三次，于倒置荧光显微镜下观察(激发波长在350 nm左右，发射波长在460 nm左右)细胞核染色情况。并于20×10高倍镜下每个培养孔随机取5个不同视野，计算凋亡率(凋亡细胞数/总细胞数)，以反应皮层神经元凋亡程度。

1.4.5Western 印迹检测PARP的表达 细胞经处理后收集，细胞裂解液冰上裂解15 min，13 000 r/min离心20 min 后提取上清液即为细胞总蛋白质。每泳道取50 mg 蛋白质在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳， 将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭液(TBS+5%脱脂奶+5% tween 20)室温封闭1 h，加入一抗(1∶5 000兔抗PARP)封闭后，作用3 h，取出膜，用TBS-T漂洗膜10 min×3 次，洗涤后加入辣根过氧化物酶耦联的二抗(1∶2 000)室温封闭30 min。室温摇床上持续平缓摇动1 h，TBS-T 漂洗膜10 min×3 次。化学发光法(ECL) 曝光胶片，显色检测相应蛋白条带。

1.4.6caspase-3 活性测定 活化的caspase-3 可催化底物Ac-DEVD-pNA，产生黄色的pNA，从而可以通过测定吸光度来检测caspase-3 的活性。同上收集细胞总蛋白。caspase-3 活性检测于96 孔板中进行，每孔加入待测样品40 μl，caspase-3 底物20 μmol/L，终体积为100 μl，并设置空白对照。混匀后37℃孵育2 h，于405 nm 处测定OD值。实验过程中同时制备pNA标准曲线。最终caspase-3的活性以正常对照组为标准，其余各组与之相比表示。

2 结 果

2.1大鼠原代皮层神经细胞体外培养及鉴定结果 神经细胞培养至第10天胞体饱满，背景清晰，折光性强，突起分支较多且形成网络(图1)。MAP-2在神经细胞的胞浆和突起中呈阳性表达，其免疫荧光染色能够反映出细胞性质及纯度。对培养至10 d的大鼠皮层神经细胞进行细胞免疫荧光化学检测，结果显示细胞胞体饱满，突起粗大，胞质内颗粒明显，与形态学检测结果相吻合，提示神经细胞生长良好。经鉴定，神经细胞的纯度为 81.34%(图1)。

图1 原代培养大鼠皮层神经元(×400)

2.2荧光素染料Hoechst33342测定人参皂苷Rb3对OGD/R诱导皮层神经元凋亡的影响 Hoechst 33342是一种亲嗜DNA 的荧光染料，与DNA 发生特异性结合后，在荧光显微镜下可检测到蓝色荧光，清楚地显示核的形态、大小及核质的密度。正常细胞呈均匀的蓝色荧光，细胞核膜光滑无皱缩、无浓缩及碎裂征，可见圆形细胞核；OGD/R损伤后，细胞核皱缩变小，密度增加，并发生浓缩，碎裂呈三角形、圆形或多边形的团块；正常对照组皮层神经元的凋亡率为(2.67±0.42)%，OGD/R组表现出明显的细胞凋亡，凋亡率为(47.12±1.23)%；与OGD/R组比较，人参皂苷Rb3组(60 mol/L)可以降低OGD/R后皮层神经元的凋亡率(26.641±1.35)(P<0.01)。但5-HD则削弱了人参皂苷抗OGD/R损伤的细胞凋亡作用，使5-HD组及人参皂苷Rb3+5-HD组细胞凋亡率分别为(44.32±2.44)%及(37.12±1.23)%。见图2。

2.3人参皂苷Rb3对OGD/R损伤后细胞中PARP的影响 如图3所示，在正常培养的神经细胞中，PARP表达较高(1.00±0.03)；而OGD/R损伤后，PARP的表达明显减低(0.58±0.13)，提示表明其完整性被破坏；人参皂苷Rb3作用后明显提高了PARP的表达水平(0.88±0.07)，与OGD/R损伤组相比具有显著的统计学差异(P<0.01)，提示人参皂苷Rb3能够通过维持PARP的完整性而对皮层神经细胞发挥保护作用。5-HD亦使PARP的完整性受到破坏，与OGD/R组无显著性差异(0.64±0.07,P>0.05)。但5-HD减弱了人参皂苷Rb3引起的PARP完整性作用(0.76±0.04,P<0.01)。

图2 Hoechst 33342染色示OGD/R诱导致皮层神经元细胞核的形态学改变(×400)

A：正常对照组；B：OGD/R组；C：人参皂苷Rb3组；D：5-HD组;E：人参皂苷Rb3+5-HD组

2.4人参皂苷Rb3 对OGD/R损伤后细胞中caspase-3活性的影响 在正常情况下，caspase-3 活性较低(1.00±0.04)；OGD/R后，神经细胞内caspase-3 的活性明显升高(3.53±0.19)，约为损伤组的3.14 倍；人参皂苷Rb3明显降低了caspase-3 的活性(1.71±0.13,P<0.01)。而应用5-HD后，caspase-3 的活性增高，与OGD/R损伤组相比无统计学差异(3.08±0.12,P>0.05)。但5-HD削弱了人参皂苷Rb3对caspase-3活性的抑制作用，使caspase-3活性约增加1.43倍(2.45±0.16)。

3 讨 论

mitoKATP是一种存在于心肌细胞线粒体膜上的主要钾通道，近年来，mitoKATP的激活在脑缺血缺氧保护中的作用越来越引人注目，大量研究显示在脑缺血缺氧过程中，mitoKATP开放，K+内流，膜去极化，减轻线粒体内Ca2+超载；减少自由基损伤，维持线粒体膜稳定性，延缓和减轻细胞凋亡〔6，7〕。

本研究通过缺氧复氧成功诱导了乳鼠神经元凋亡，通过DNA荧光染色Hoechst染色观察到人参皂苷Rb3干预后对体外培养神经细胞凋亡影响。实验发现，人参皂苷Rb3可以明显降低缺氧/复氧后神经元的凋亡率，改善细胞形态。在应用人参皂苷Rb3预处理的同时应用mitoKATPC特异阻断剂5-HD则消弱了其抑制神经元凋亡作用。

PARP是定位在细胞核内，在应激条件下与DNA修复密切相关的一种酶，它的存在对于细胞的稳定和存活非常重要。PARP在体外可以被多种caspases剪切，在体内则是caspase-3的主要剪切对象，因此，PARP的剪切被认为是细胞凋亡的一个重要指标，也通常被认为是caspase-3激活的指标。在正常培养的神经细胞中，PARP表达较高，caspase-3活性也较低；而OGD/R损伤后，PARP的表达明显减低，提示其完整性受到破坏，同时凋亡蛋白caspase-3活性增强，神经元凋亡率增高；人参皂苷Rb3明显提高了PARP的表达水平，降低了caspase-3活性，与OGD/R损伤组相比具有显著统计学差异。而5-HD则削弱了人参皂苷Rb3对PARP完整性的维持，增强了caspase-3的活性，促使神经元凋亡，即5-HD抑制了人参皂苷Rb3的抗凋亡作用。由此推测，人参皂苷Rb3可能通过开放mitoKATPC，抑制激活的caspase-3对其特异性底物进行裂解而缓解细胞凋亡，起到脑缺血保护。

4 参考文献

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