p16INK4A蛋白及HPV感染与宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌的相关性分析

傅小一 张子雯

(宜春学院医学院病理教研室，江西 宜春 336000)

人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要致病因素〔1，2〕。在正常宫颈上皮向宫颈鳞癌转变的进展过程中，HPV可以导致某些基因结构以及功能发生变化，其中p16INK4A基因是一种可以作用于细胞周期的抑癌基因，该基因主要调控细胞的生长和分化，参与肿瘤的形成与发展〔3〕。越来越多的研究表明，p16INK4A基因可能作为一种生物学标记应用于宫颈癌的早期筛查〔4，5〕。 本研究拟探讨p16INK4A蛋白与HPV感染在宫颈癌发生发展中的关系，以期寻找可靠的宫颈癌早期筛查的标志物。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2012年1月至2013年8月来宜春市中医院就诊，并在妇产科门诊行宫颈活检和宫颈手术的患者122例，年龄53～81〔平均(53.47±3.85)〕岁，其中慢性宫颈炎22例，宫颈上皮内瘤样变(CIN)Ⅰ28例、CIN Ⅱ 20例、CIN Ⅲ29例，宫颈鳞癌的23例。所有选用的病例在术前均未接受过任何治疗，且均经过病理学检查证实。

1.2HPV DNA检测 根据核酸分子杂交基因的原理，选用HPV DNA检测试剂盒，根据说明书用采样刷于宫颈内取样，标本置于液体培养基中保存。高危型亚型中的16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68亚型阳性为HPV检测阳性。

1.3p16INK4A蛋白的检测 采用免疫组织化学方法检测，取宫颈组织石蜡切片，按试剂盒说明书进行操作，一抗用鼠抗人的p16INK4A单克隆抗体，1∶100稀释。阴性对照为磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗，阳性对照为已知阳性的胰腺切片。

1.4免疫组化阳性结果判定 在400倍电子显微镜下观察，取10个视野，计数500个细胞中的阳性细胞数，根据阳性细胞多占的比例及染色的强弱判定结果。细胞核或者细胞质内颗粒被染成棕黄色为p16INK4A阳性。染色强度与背景颜色无明显差异或者阳性细胞百分率<10%为阴性结果；染色强度较弱或阳性细胞百分率为10%～30%为弱阳性(+)；阳性细胞百分率为31%～60%为中度阳性()；而阳性细胞百分率>60%为强阳性()。

1.5统计学分析 采用SPSS11.0软件进行分析，计量资料用χ2检验，相关分析用Spearman相关分析。

2 结 果

2.1宫颈组织中p16INK4A的表达 p16INK4A蛋白主要表达于细胞核及细胞质中，在慢性宫颈炎中，p16INK4A蛋白几乎不表达，在CIN Ⅰ级，p16INK4A蛋白的表达率为46.43%(13/28)，在CIN Ⅱ级为75%(15/20)，CIN Ⅲ级82.86%(24/29)，在宫颈鳞癌中为91.3%(21/23)。随着宫颈病变的程度加重，p16INK4A蛋白的表达率逐渐上升，各级别宫颈病变中p16INK4A蛋白的表达率差异具有统计学意义(χ2=26.19，P=0.000)。并且p16INK4A蛋白的表达强度与宫颈病变程度呈正相关(r=1.216，P=0.000)，见表1，图1。

图1 p16INK4A蛋白在宫颈组织的表达情况(×100)

表1 p16INK4A蛋白在宫颈组织的表达(n)

2.2宫颈组织中HPV的感染情况 慢性宫颈炎的HPV感染率为22.73%(5/22)，CIN Ⅰ中HPV感染率为39.29%(11/28)，CIN Ⅱ中为55%(11/20)，CIN Ⅲ中为55.17%(16/29)，宫颈鳞癌中为73.91%(17/23)，随着宫颈病变的程度加重，HPV的感染率也越来越高，并且各级别宫颈病变之间HPV感染率差异显著(χ2=18.231，P=0.0066)，且宫颈病变的程度与HPV的感染率也呈正相关(r=0.628，P=0.0062)。

2.3宫颈病变HPV感染分型 在各个级别宫颈病变中HPV感染位于前3位的HPV亚型。见表2。

表2 各级别宫颈病变HPV感染分型〔n(%)〕

2.4不同级别宫颈病变中HPV感染与p16INK4A蛋白的相关性分析 在122例患者中HPV的总感染率为49.18%(60/122)，p16INK4A蛋白的阳性率为59.84%(73/122)，p16INK4A蛋白、HPV均阳性45例，均阴性34例，仅HPV阳性15例，仅p16INK4A蛋白阳性28例。Spearman相关性分析发现HPV的感染与p16INK4A蛋白的表达具有相关性(r=0.628，P=0.0015)。

3 讨 论

p16INK4A是一种与细胞周期有关的抑癌基因，它的抑癌作用主要是通过直接作用于细胞周期，调控细胞的生长和分化产生的〔6〕。有研究表明，p16INK4A在宫颈鳞癌和宫颈上皮内瘤样病变组织中高表达，可能可以作为一种宫颈鳞癌早期筛查的生物学标记〔7〕。

HPV是一种DNA病毒，其持续感染是宫颈鳞癌和宫颈上皮内瘤样病变发生的必要因素〔8，9〕。宫颈鳞癌的流行病学研究发现高危型HPV的感染是引起宫颈鳞癌的高危因素，而低危型引起宫颈鳞癌的概率相对高危型HPV小很多，其中HPV16是高危型HPV中最常见的致病亚型〔10〕。与本研究结果相同。

本研究显示p16INK4A蛋白的表达可能可以提示HPV感染导致宫颈上皮细胞发生病变的程度，相对于HPV对宫颈上皮内病变的检测敏感度，p16INK4A蛋白的表达更准确、敏感，且检测方法相对简单易操作。如果联合使用p16INK4A蛋白标记检测与HPV感染检测结合可以做出较为准确的宫颈鳞癌早期诊断。

4 参考文献

1Kocak I,Ustün C.Effects of metformin on insulin resistance, androgen concentration, ovulation and pregnancy rates in women with polycystic ovary syndrome following laparoscopic ovarian drilling〔J〕.J Obstet Gynaecol Res,2006;32(3):292-398.

2韩淑霞,赵俊杰,王秀琴,等.宫颈细胞学、HPV-DNA及阴道镜检查在宫颈病变早期诊断中的应用〔J〕.宁夏医科大学学报,2011;33(1):86-8.

3余 俐,彭 青,陈尚武,等.宫颈上皮内瘤变中p16INK4A和Ki-67的表达〔J〕.临床与实验病理学杂志,2007;23(6):665-8.

4Saad RS,Mashhour M,Noftech-Mozes S,etal.P16INK4a expression in undifferentiated carcinoma of the uterus does not exclude its endometrial origin〔J〕.Int J Gynecol Pathol,2012;31(1):57-65.

5Shimazui T,Yoshikawa K,Miyazaki J,etal.Systemic transduction of p16INK4A antitumor peptide inhibits the growth of MBT-2 mouse bladder tumor cell line grafts〔J〕.Int J Oncol,2013;42(2):543-8.

6van Bogaert LJ.P16INK4a immunocytochemistry/immunohistochemistry: need for scoring uniformization to be clinically useful in gynecological pathology〔J〕.Ann Diagn Pathol,2012;16(5):422-6.

7Gu Z,Cao X,Jiang J,etal.Upregulation of p16INK4A promotes cellular senescence of bone marrow-derived mesenchymal stem cells from systemic lupus erythematosus patients〔J〕.Cell Signal,2012;24(12):2307-14.

8李 华,阿依努尔·买买提,路 玲,等.南疆维吾尔族妇女宫颈癌与HPV感染及HLA-DRB1基因多态性的关系研究〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志,2011;31(1):74-80.

9Cardesa A, Nadal A. Carcinoma of the head and neck in the HPV era〔J〕. Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat,2011;20(3):161-73.

10De-Castro Arce J,Gockel-Krzikalla E,Rosl F.Silencing of multi-copy HPV16 by viral self-methylation and chromatin occlusion: a model for epigenetic virus-host interaction〔J〕. Hum Mol Genet,2012;21(8):1693-705.