组织因子信号抑制因子-2在小细胞肺癌发生和进展过程中的作用

刘振丽 姜 伟

(济宁医学院附属医院呼吸内一科，山东 济宁 272000)

小细胞肺癌(SCLC)属于神经内分泌肿瘤(约占15%)，其中未转移病人的生存率为10%，只有不到10%的病人适合进行手术切除治疗，而晚期SCLC患者的5年生存率仅2%，因此SCLC的转移和进展研究是目前肿瘤基础研究的重点之一〔1〕。组织因子信号通路抑制因子(TFPI)-2，是一种32 kD大小的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，分泌到细胞外基质(ECM)中，被认为是一种抑癌基因。因为TFPI-2可抑制血纤维蛋白溶解酶的活性，参与基质金属蛋白酶(MMP)的激活〔2〕，调控ECM的降解和肿瘤细胞浸润。大部分恶性肿瘤，例如神经胶质瘤、胰腺癌、肝细胞癌TFPI-2表达下调。在细胞中稳定转染或通过融合腺病毒导入TFPI-2后，可降低了癌细胞的浸润性〔3〕，但目前，还没有研究观察TFPI恢复表达或者高表达对肺癌，特别是SCLC的进展影响。本研究检测SCLC患者组织标本中TFPI-2的表达，评估恢复TFPI-2表达后NCI-H209细胞系移植瘤中肿瘤生长的情况。

1 材料与方法

1.1肿瘤组织标本 2012年2～8月通过支气管镜(n=33)和纵隔镜(n=7)活检获得SCLC病例资料和标本。根据2004年世界卫生组织(WHO)分类标准，确定为原发性SCLC，男30例，女10例，35～84岁。中位年龄65岁，97%的病人是吸烟者。25例确诊时处于晚期，且有转移。仅有2例在最后一次随访时仍存活，且病例数据可用。中位总生存期为6个月，2年生存率为5.5%。临床数据记录齐全，有可用于免疫组织化学分析的组织标本。查阅病人治疗记录，收集如下相关数据：确诊时年龄、性别、吸烟史、相关并发症、肿瘤分级和转移、最后一次随诊或死亡时间。肿瘤分期根据2004年WHO推荐的Veterans’ Administration Lung Study Group(VALSG)标准进行。研究经过我院的伦理委员会批准，并由患者签署知情同意书。

1.2细胞培养和转染 SCLC细胞系NCI-H209购自ATCC(LGC Promochem，Molsheim，法国)，在37℃含有5% CO2的孵箱中培养。使用4 μg pCMV-luc plasmid(Clontech，Saint Quentin en Yvelines，法国)质粒，以Lipofectamine2000(Invitrogen)作为转染剂，根据试剂说明书进行转染后使用G418筛选稳定高表达荧光素酶(NCI-H209 Luc cells)的细胞，获得稳定转染克隆后用含50 μg/ml G418(Invitrogen)进行培养。NCI-H209 Luc细胞转染4 μg pEF6/V5-His TOPO质粒(Invitrogen)，包含有TFPI-2 cDNA 或空白质粒两种，3 w后获得转染成功的细胞克隆，选择稳定转染高TFPI-2的细胞克隆。用反转录和实时PCR、Western印迹、免疫组织化学染色检测TFPI-2的表达，最终形成3个克隆，即含空白转染质粒的细胞852(不表达TFPI-2)及编码TFPI-2的质粒转染形成表达TFPI-2的两个细胞克隆(T6、T28)用于进一步的实验。通过qPCR检测发现，T6克隆TFPI-2的表达量(138 980拷贝)最高(图1)。T28克隆中TFPI-2 蛋白没有T6克隆表达强(46 780拷贝)，而852细胞中无TFPI-2的表达。T28和T6克隆中TFPI-2 mRNA表达相对于852细胞，升高6 000倍和18 000倍。

图1 表达不同量的TFPI-2的人SCLC高致瘤性NCI-H209 Luc细胞

1.3SCLC裸鼠移植瘤实验 4 w龄无病原菌雄性BALB/c裸鼠，在无菌饲养环境中稳定2 w，根据国家研究机构指南进行饲养。所有实验步骤获得了伦理委员会相关授权者的监督并同意后进行。移植前，NCI-H209 Luc细胞离心后收集(3 min，200 r/min)，并用无FCS培养基洗两次，胎盘蓝染色后进行细胞活力计数(>95%)。将细胞稳定转染表达荧光素酶的质粒中的一个克隆注射通过气管插管注射到小鼠肺部，并同时皮下注射到小鼠背部，观察肿瘤的生长情况。

1.4生物荧光显影 注射100 mg/kg D-荧光素(Promega，Charbonnieres，法国)，将小鼠用2%的异氟烷麻醉4 min后，进行生物荧光显影。使用IVIS Lumina仪器(Caliper LS，Hopkinton MA，USA)显示低密度区和叠加层灰度参考图像，计算肺部区域(Living Image software，V.2.GO，CaliperLS)的所有电子总和的信号强度。采用微型计算机断层扫描(CT)检测肿瘤的部位，并测量。根据图像中肿瘤的宽度(W，轴向)、高度(H，中-矢状)、长度(L，中-矢状)测量肿瘤大小和体积，公式4/3π(W/2×H/2×L/2)。

1.5小鼠标本收集和组织病理分析 小鼠在麻醉状态下断颈处死，开腹，检测喉、体腔中是否有转移癌，保存每只老鼠的肺、气管、肝、脾、脑。所有器官用10%甲醛溶液浸泡后，用石蜡包埋，切成5 μm厚的切片，并用标准HES染色程序进行染色。使用Lab Vision Autostainer(Lab Vision 公司)自动染色机进行免疫组织化学染色，用生物素-地高辛免疫组化学检测体系和二氨基联苯胺作为底物进行显色(UltraVision，Lab Vision公司)。切片苏木素复染。半定量分析细胞核和细胞质的着色强度，得分范围0～3(无着色=0，弱着色=1，中度着色=2，强染色=3)。通过将表达荧光素的细胞种植到裸鼠皮下进行研究观察肿瘤的生长状况，每隔2 w，用生物发光图像进行检测。

1.6统计分析 采用SPSS16.0软件进行t检验(双尾)，或Mann Whitney检验。

2 结 果

2.1人小细胞肺癌中TFPI-2 和MMP的表达 26例低表达TFPI-2(染色强度，细胞核0，细胞质1)，14例高表达TFPI-2，包括1例染色强度为3的病例。50%的标本中MMP-1高表达(图1)。MMP-2、-3、-9的染色强度为1的病例分别占50%、57.5%、61.5%。SCLC病例中TFPI低表达(染色强度0，1)标本中，有88%的样本MMP-1高于TFPI-2(染色强度2)。在高表达TFPI-2(染色强度2，3)的组织中，MMP的染色强度普遍低于TFPI-2(染色强度0，1)。见图2。

图2 免疫组织化学分析SCLC样本

2.2TFPI-2上调表达降低了裸鼠移植瘤的发展 手术后，有1只小鼠死亡，2只小鼠死于肿瘤生长过程。9 w后，95%的小鼠都长出了肿瘤，气道生物荧光较弱小鼠占5%。在852对照细胞小鼠移植瘤中，移植3 w时，生物荧光强度最强，7～9 w时荧光强度稳定(表1)。而T6克隆3 w时荧光强度较弱，随后开始增强，但7 w时仍显著低于852细胞。应用CT扫描肿瘤部位和大小。所有动物，肿瘤位于肺底部和中部，生物荧光和CT测量的肿瘤大小有很好的一致性(r=0.87)。T6克隆的小鼠肿瘤明显小于852小鼠。小鼠标本的组织化学切片分析表明，肿瘤边界清晰。支气管受压迫，肺泡受到浸润和破坏。移植瘤中部出现坏死，特别是852细胞，周围有大量巨噬细胞。9 w时体内肿瘤切片进行了免疫组化染色分析TFPI-2的表达，在T6细胞形成的肿瘤中高表达(图3)。

表1 852和T6细胞荧光强度比较

图3 表达TFPI-2和不表达TFPI-2的NCI-H209细胞成瘤生长情况

3 讨 论

TFPI-2是一种潜在的血纤维蛋白溶解酶抑制因子，可以通过激活MMPs参与肿瘤进展的蛋白酶，因此，TFPI-2是一种潜在的肿瘤浸润和转移的抑制因子。在诸如神经胶质瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、非小细胞肺癌的恶性肿瘤中低表达〔4〕。但是，SCLC作为一种恶性程度最高的肺癌，受限于标本来源，对TFPI-2在肿瘤进展中的作用机制研究甚少〔5〕。本研究提示TFPI低表达与肿瘤的预后不良有关。TFPI-2的低表达可能是由于启动子的甲基化造成，尤其是在非SCLC(NSCLC)晚期病人中。一项研究也发现：TFPI-2启动子区的甲基化同NSCLC病人的预后差显著相关，表明TFPI-2基因的甲基化或TFPI-2的表达或许是预后差的独立预测因子。NCI-H209细胞系来源小细胞肺癌骨转移的病人，该细胞体积小，有显著的神经内分泌特性，培养时聚集生长，边界不规则〔6〕。基因组测序表明，NCI-H209细胞RB1和TP53缺失，因而该细胞系能够代表该疾病的所有特征〔7〕。当有组织坏死出现时，低发射光通过氧化荧光素酶底物，可降低了ATP的消耗，因此，使肿瘤细胞的数目减少。但借助2D生物荧光成像和扫描技术，仍可以清楚地证明TFPI-2表达的肿瘤细胞肿瘤体积小。对纤维肉瘤中也证实TFPI-2的恢复表达能够降低肿瘤的生长速度〔8〕。

肿瘤的发生发展涉及多种机制，包括细胞增殖和凋亡，细胞迁移和浸润。在这个过程中包含了ECM被一系列的诸如MMP蛋白酶的降解。在胰腺癌、食管癌、鼻咽癌、前列腺癌中发现TFPI-2的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖。一些研究对其机制进行了研究〔9〕，发现TFPI-2可降低了细胞的增殖能力，将细胞阻断在G1/S期，这同细胞周期依赖的激酶抑制因子p15和p27有关。p27(通过调控CDK2将细胞阻断在G1/S期)在细胞周期中的调控作用，例如在胰腺癌和纤维肉瘤中，都已经有报道〔10〕。有研究通过腺病毒，将p27转入NSCLC细胞中，使细胞停滞在G1/S期，并抑制了裸鼠移植瘤的增长。说明p27的低表达同病人预后差有关，在NSCLC中，p27表达高，病人生存期长。这也是TFPI-2肿瘤制效应的机制之一〔11〕。

肿瘤细胞的浸润和进展也需要ECM降解，主要是通过蛋白酶，特别是MMP。研究报道〔12〕，TFPI-2是一种MMP活性的抑制因子，主要通过抑制纤溶酶来抑制MMP-1、-2、-3、-9。另外，除直接抑制外，TFPI-2也抑制MMP-1和-3的表达，来抑制肿瘤的增殖。SCLC手术切除标本稀少，主要是支气管镜和纵隔镜检查标本，因此仅仅够用于免疫组织化学分析。TFPI-2对MMP表达的影响仍需要进一步的研究。

4 参考文献

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5Hibi K，Goto T，Kitamura YH，etal.Methylation of TFPI2 gene is frequently detected in advanced well-differentiated colorectal cancer〔J〕.Anticancer Res，2010；30(4)：1205-7.

6Jia Y，Yang Y，Brock MV，etal.Methylation of TFPI-2 is an early event of esophageal carcinogenesis〔J〕.Epigenomics，2012；4(2)：135-46.

7Takada H，Wakabayashi N，Dohi O，etal.Tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2) is frequently silenced by aber-rant promoter hypermethylation in gastric cancer〔J〕.Cancer Genet Cytogenet，2010；197(1)：16-24.

8Kisiel JB，Yab TC，Taylor WR，etal.Stool DNA testing for the detection of pancreatic cancer，assessment of methylation marker candidates〔J〕.Cancer，2011；118(10)：2623-31.

9Ma S，Chan YP，Kwan PS，etal.MicroRNA-616 induces androgen-independent growth of prostate cancer cells by suppressing expression of tissue factor pathway inhibitor TFPI-2〔J〕.Cancer Res，2011；71(2)：583-92.

10Tang Z，Geng G，Huang Q，etal.Expression of tissue factor pathway inhibitor 2 in human pancreatic carcinoma and its effect on tumor growth，invasion，and migration in vitro and in vivo〔J〕.J Surg Res，2011；167(1):62-9.

11Iochmann S，Lerondel S，Blechet C，etal.Monitoring of tumour progression using bioluminescence imaging and computed tomography scanning in a nude mouse orthotopic model of human small cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer，2011；77(1)：70-6.

12Vaitkiene P，Skiriute D，Skauminas K，etal.Associations between TFPI-2 methylation and poor prognosis in glioblastomas〔J〕.Medicina (Kaunas) ，2012；48(7)：345-9.