瘦素对大鼠气道平滑肌β2肾上腺素能受体表达的影响

陈云峰 朱述阳 刘向群 刘文静 吴 瑕 倪文静

(徐州医学院附属医院呼吸内科，江苏 徐州 221002)

研究证实肥胖是支气管哮喘(简称哮喘)的危险因素，并且可使哮喘发展为难治性哮喘〔1〕，而瘦素(LP)是脂肪组织表达的促炎分子的中心成员，在哮喘发病中具有重要的作用，能够促进多种炎症介质的释放，并可促进气道平滑肌细胞的增殖〔2〕，其在血清浓度升高可导致肺功能下降。β2肾上腺素能受体(β2-AR)在肺内分布广泛，哮喘的发作与β2-AR失常有密切联系〔3〕。β2-AR与肺功能密切相关，在哮喘急性发作时β2-AR数量减少，使细胞内环磷腺苷(cAMP)下降，这是支气管痉挛的重要原因。多种炎症介质可以抑制β2-AR的表达，如白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α等。有研究显示，肥胖时β2-AR表达降低并且存在基因多态性变化，但其作用机制尚不明确，考虑可能与LP有关。本实验拟从细胞水平研究LP对大鼠气道平滑肌β2-AR表达的影响，进一步了解LP在哮喘发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 150～200 g SD大鼠(徐州医学院实验动物中心提供)；LP(Alexis公司)；DMEM 培养基(Gibco公司 )；兔抗大鼠β2-AR(武汉博士德公司)；胎牛血清(杭州四季青有限公司 )；胰蛋白酶(Sigma 公司)；PBS(北京中杉公司)；TRIzol总RNA提取试剂盒；RT-PCR一步法检测试剂盒(北京天根公司)；PCR引物(上海生工生物有限公司)；瘦素拮抗剂(ProSpec-Tany公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)的培养 将大鼠用水合氯醛麻醉后，在无菌条件下纵行剖开气管，小心剥离外膜，并轻轻刮除内膜，用眼科剪将其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，将组织块移入培养瓶瓶底，等距排列，倒置培养瓶，加入含25%胎牛血清的培养液3 ml，将贴有组织块的一侧朝上，使其不与培养液接触，置于37℃含5%CO2培养箱中，3 h后轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中，半开放式静置培养3 d后将培养液添至5 ml，继续置于37℃含5%CO2培养箱中静止培养，第6天全换液，此后每3 d换液1次。ASMCs通过传代自然纯化，实验用第4～6代细胞。随机分为空白对照组(A组)，LP 50、100、200 ng/L组(B、C、D组)及LP拮抗剂组(LP 200 ng/L+LP拮抗剂200 ng/L，E组)。

1.2.2细胞鉴定 ①细胞形态学:应用倒置相差显微镜观察，观察细胞的大小、形态及排列方式等。②免疫荧光染色法:将消毒好的大小合适的玻片放入六孔培养板的孔内，把收集好的细胞加入孔内，加入2 ml高糖培养基。待细胞融合约50%～60%时取出玻片,加入37 ml/L甲醛液在室温下固定30 min，用100 ml/L山羊血清(PBS配制)封闭非特异性抗原30 min，抗SMC-α-actin(1∶200 PBS稀释)室温下孵育细胞2 h，用荧光标记二抗(1∶200 PBS稀释)在4℃孵育细胞过液，然后用荧光封片剂封片后在荧光显微镜下检测。

1.2.3Western印迹法测定瘦素受体(Ob-R)及β2-AR的蛋白表达 按照实验分组干预24 h后提取细胞蛋白。依次经配胶、加样、电泳、电转及封闭后，分别加入兔抗大鼠β2-AR抗体过夜，洗膜后，加入二抗(小鼠抗兔IgG)孵育2 h，以NBT/BCIP显色后用Image J软件分析条带的灰度。

1.2.4实时荧光半定量PCR测定Ob-R及β2-AR的表达 荧光实时定量RT-PCR 法测定：分组同上，干预24 h后收集ASMCs，TRNzol法提取总RNA，紫外分光光度法测定RNA浓度。扩增β2-AR基因引物序列：上游：5′-GAGACCCTGTGCGTGATTGC-3′；下游；5′-CCTGCTCCACCTGGCTGAGG-3′扩增产物长度265 bp；扩增内参照β-actin基因引物序列:上游：5′-ACTCAGGAACGGGACGAA-3′；下游：5′-TGATTGCAGTGGATCGCTA-3′扩增产物长度257 bp。PCR扩增条件为：94℃ 5 min，94℃ 45 s，72℃ 60 s，共进行40个循环。扩增Ob-R基因引物序列：上游：5’-CAGATTCGATATGGCTTAAATGG-3’，下游：5’-GTTAAAATTCACAAGGGAGGCA-3’，扩增产物长度 474 bp。扩增内参照β-actin基因引物序列:上游：5’-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’，下游：5’-AGCCATGCCAAATGTGTCAT-3’，扩增产物长度为473 bp。Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。采用相对定量方式表示各组β2-AR mRNA表达。检测结果以每个样本目的基因CT平均值减去内参CT平均值，对应为每个样本的CT值(△Ct)。

2 结 果

2.1ASMCs鉴定 在倒置显微镜下，培养的ASMCs呈梭形，平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状。免疫荧光染色法表明，抗平滑肌肌动蛋白抗体呈阳性染色者，胞质内可见大量绿色荧光，证实所培养细胞为ASMCs(图1)。

2.2Western印迹法检测β2-AR及Ob-R蛋白的表达 与A组相比，Ob-R蛋白表达逐渐升高(P<0.05)；予LP拮抗剂后，Ob-R表达较LP干预组降低(P<0.05)，较A组无显著差异(P<0.05)。与A组相比，β2-AR蛋白表达逐渐降低(P<0.05)；予LP拮抗剂后，β2-AR表达较LP干预组升高(P<0.05)，较A组无显著差异(P<0.05)。见图2，图3。

图1 ASMCs的鉴定(×100)

1～5:A、B、C、D、E组

1～5：A、B、C、D、E组

2.3实时荧光半定量RT-PCR测Ob-R及β2-AR mRNA的表达 与A组相比,B、C、D组Ob-R表达明显升高，而β2-AR表达下降，证实LP可以上调Ob-R的表达并抑制β2-AR的表达；E组Ob-R表达较B、C、D组下降(P<0.05)，与A组相比(P>0.05)；E组β2-AR表达较B、C、D组升高(P<0.05)，与A组相比(P>0.05)。见表1。

表1 Ob-R及β2-AR的相对表达量值)

3 讨 论

1980～2008年，儿童中哮喘的发病率从3.5%上升至9.4%，在成人中由2.9%升高至7.3%〔2〕。与此同时，在美国20岁以上的成年人中，接近65%为超重或者肥胖的，这一数据与10年前相比升高了10%〔4〕。肥胖是哮喘的危险因素之一〔5，6〕，并且加重了哮喘的严重程度〔7〕。肥胖对哮喘的影响有很多方面，炎症因素是肥胖促进哮喘的主要机制。吸入糖皮质激素、β2肾上腺素能受体激动剂和胆碱能受体拮抗剂是目前用来治疗哮喘的最基本药物，主要通过抑制气道炎症和扩张支气管而改善哮喘症状。与正常体重患者相比，肥胖的哮喘患者需要应用更大剂量的β2-AG及激素〔8〕。有研究显示，减肥可以减轻哮喘的严重程度及症状〔9，10〕。

LP是脂肪组织表达的促炎分子的中心成员，肥胖患者的血清LP水平比正常人高4～6倍〔11〕。LP主要通过作用于Ob-R而发挥作用，在气道平滑肌细胞中存在Ob-R的表达。徐成胜等〔12〕研究发现LP可在体外上调血管平滑肌细胞Ob-R的表达，但在气道平滑肌细胞中研究甚少，本研究发现，与空白对照组比较，LP干预后可于体外上调气道平滑肌细胞Ob-R表达。LP在哮喘的发病过程中起重要的作用，它可以刺激促炎细胞因子的产生，如IL-6，TNF-α，白三烯等〔13，14〕，并且可以促进气道平滑肌细胞的增殖。同时平滑肌细胞表形的改变可能是决定重度哮喘对激素敏感性较差的原因之一〔15〕。研究证实，血清LP浓度与肺功能密切相关，降低血清LP水平可使肺功能升高。

β2-AR是一种G蛋白耦联受体(GPCRs)，GPCRs关联着体内信号传导、细胞增殖、分化和凋亡、损伤后修复等诸多过程，β2-AR广泛分布于支气管平滑肌和肺组织内，β2-AR的数量与肺功能呈负相关。当哮喘发作时，受反复使用β2-AG及多种炎症介质，如白三烯、前列腺素等作用的影响，使β2-AR含量明显降低〔16〕，导致气道平滑肌痉挛，过敏介质释放增加，黏膜水肿和黏液分泌增加等病理变化。在外周白细胞β2-AR的研究中发现，IL-1，TNF-γ及GM-CSF均可影响其功能。有研究〔17〕证实豚鼠肺泡巨噬细胞产生的氧自由基数量级气道β2-AR功能损害程度之间存在密切相关，用大鼠进行的实验也显示了氧自由基可致β2-AR密度降低。β2-AG是目前临床应用最广的支气管解痉剂，已广泛应用于支气管哮喘的急性发作的治疗，可以有效地缓解哮喘的急性症状，并且可以抑制气道平滑肌细胞增殖。β2-AG治疗支气管哮喘的药理机制是通过选择性刺激气道内的β2-AR，从而松弛气道平滑肌，达到支气管扩张效应〔18〕。在肥胖的哮喘患者中发现，其对β2-AG的反应性降低，与研究结果一致。

本研究结果提示LP可以呈浓度依赖性抑制气道平滑肌细胞β2-AR的表达。可能的机制有：①LP可能通过上调PKA，使其介导的受体磷酸化后被吞，并被传输到溶酶体后被降解，也有可能是通过cAMP途径使β2-AR表达降低。②LP可能通过PI3K通路，作用于Rho蛋白家族调节β2-AR的表达。本实验以体外培养细胞观察到了这一现象，与动物模型及人类有一定的差别，所以下一步可以通过动物模型及人体实验等进行研究，进一步探讨了LP在支气管哮喘发病中的作用，为哮喘的预防提供了一个新的思路。

4 参考文献

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