维生素E对离心运动后大鼠骨骼肌波形蛋白表达的影响

吴翊馨 张海平 高 岩 苏胜林

(沈阳体育学院，辽宁 沈阳 110102)

随着细胞骨架波形蛋白(Vimentin)在1978年从细胞中发现以来，其在肌肉病理研究等领域中的应用价值逐渐被人们所认识〔1〕。越来越多的肌肉病理专家认为，了解并掌握细胞骨架蛋白特别是 Vimentin在损伤肌肉再生过程中的表达是深刻理解肌肉损伤病理机制的一个重要环节。维生素E(VE)作为一种抗氧化剂，具有清除自由基的功效，可减轻运动中抗氧化酶所受的自由基损伤，进而提高运动能力。本文探讨VE对骨骼肌 Vimentin表达的影响，为骨骼肌损伤的防治与康复等提供重要的实验依据。

1 材料与方法

1.1材料与分组 雄性SD大鼠16只，体重(304±12)g，随机分为安静对照组(con)、运动后24 h组(24 h)、VE对照组(VEcon)、VE运动后24 h组(VE 24 h)，每组4只，组间动物体重无显著性差异。VE 24 h组药物注射采用腹腔注射方法，VE注射量为1～1.2 mg/kg，注射液体总量为4 ml/kg，初次注射时间为鼠正式实验前1 h，以后每8 h注射1次，直至处死；VEcon组以生理盐水为对照，注射方式、注射量及运动方式、处死时间同VE 24 h组。

1.2运动方式 用一次性下坡跑运动训练建立运动损伤模型。正式实验前2 d，所有动物进行5～10 min跑台运动，以熟悉跑台，速度为5～10 m/min，坡度为0。正式实验时，所有运动组动物均进行持续性下坡跑，速度为16 m/min，坡度为-16，总运动时间为200 min，100 min运动结束后，动物休息5 min，然后再进行100 min运动。运动结束后，将动物放回笼中，同样条件饲养，直到处死。

1.3取材及处理 运动结束后，各组按不同时间点，腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉动物，麻醉剂量为0.25～0.5 g/kg。迅速取出同侧肱三头肌，剔除筋膜等结缔组织，冰冷生理盐水清洗，并迅速置于10%甲醛钙固定液中固定。

1.4骨骼肌Vimentin免疫组化切片制作与分析 Vimentin免疫组化试剂盒采用武汉博士德生物工程有限公司产品，严格按照试剂盒程序进行免疫组化切片制作。每组骨骼肌组织标本每种抗体染色切片各取6张，每张切片按对角线划分区域任选取5个视野，显微镜下观察(×400)，并用 Motic Image 3.0分析软件对视野进行分析。参数设定：(1)目标总面积占图像视场的百分比(%)=(目标总面积÷视野区域面积)×100%，反映Vimentin的相对含量；(2)灰度总和：视野区域面积内Vimentin的总含量，反映染色强度。

2 结 果

与con组相比，VEcon组和24 h组大鼠骨骼肌vimentin目标面积百分比均有明显增加，分别con组的116.23%和118.46%(P<0.01)，VEcon组和24 h组两组间结果无显著性差异(P>0.05)；与VEcon组和24 h组相比，VE 24 h组目标面积百分比有所增加，分别为VEcon组和24 h组的109.20%和107.15%，但无显著性差异(P>0.05)；与con组相比，VE 24 h组有显著性增加(P<0.01)。见表1。

灰度总和的变化与目标面积百分比的变化类似，VEcon组和24 h组有显著性增加(P<0.01)，分别为con组的153.40%和153.12%；与VEcon组和24 h组相比，VE 24 h组灰度总和亦有所增加，分别为VEcon组和24 h组的107.56%和107.76%，但无显著性差异(P>0.05)；VE 24 h组比con组显著性增加，为安静对照组的165.01%(P<0.01)。见表1。

表1 大鼠离心运动前后不同时刻骨骼肌vimentin形态测量结果

3 讨 论

Vimentin是近年来有关骨骼肌损伤与恢复研究中的一个热点〔2〕。研究发现，运动会引起骨骼肌细胞骨架蛋白的结构发生变化。Bornemann等〔3〕采用向比目鱼肌中注射热的林格氏液，发现肌母细胞和幼稚的肌管细胞都有 Desmin和 Vimentin的表达，且随着肌细胞的成熟，这两种蛋白的表达均有降低，分布也由原先的散在转为固定在Z板水平；Vimentin在伤后2～4 w，在肌纤维中消失，而 Desmin仍然存在，故认为 Vimentin是观察肌肉再生的一个最好指标。

人体运动时需要更多的能量，机体对氧的摄取和消耗都会增加，体内自由基也将成比例增加。在自由基增加的同时，大强度运动也消耗机体的抗氧化物质，从而降低机体的抗氧化能力。急性运动可诱发内源性自由基产生增加和脂质过氧化反应增强，造成对生物膜结构的损伤，这可能与运动性损伤和疲劳的形成有关。运动可通过多种代谢途径使机体组织中自由基生成增多〔4〕，同时自由基清除能力相对减弱〔5〕，使自由基在组织中积累，引起与疲劳发生有一定关系的生物膜结构变化，甚至组织损伤。VE有许多功效，其最突出的化学性质是抗氧化作用，它能增强细胞的抗氧化作用，有利于维持各种细胞膜的完整性，参加整体的某些细胞组织多方面的代谢过程，保持膜结合酶的活力和受体等作用。VE作为细胞膜内重要的抗氧化物和膜稳定剂，在维持肌肉组织的正常结构和代谢，特别是在肌肉收缩期间的能量供给和Ca2+摄取和释放有着重要的作用。余斌等〔6〕报道，口服VE可显著提高大鼠骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低脂质过氧化水平和线粒体游离钙浓度，提高线粒体膜稳定系数。VE保护大鼠线粒体膜稳定性的原因可能是增强线粒体SOD活性，消除了更多的自由基，减少了运动中的氧化应激，从而减轻了脂质过氧化；脂质过氧化作用的减弱使线粒体膜更加稳定，抑制了骨骼肌线粒体游离钙的聚积，进一步抑制脂质过氧化作用。国内外一些学者认为，VE的抗氧化作用抑制了运动中自由基的生成而间接保护了细胞膜的稳定性，从而减少了Ca2+的内流。国外一些学者认为，VE的衍生物普遍参与了质膜的组成，VE可增强肌细胞膜、线粒体膜和肌浆网膜的完整性、稳定性，防止肌浆网内Ca2+的大量溢出引发骨骼肌的损伤〔7〕。

在本研究中，骨架蛋白免疫切片的图像分析所示的目标总面积占图像视场的百分比和灰度总和，反映的是 Vimentin的相对含量，间接的代表骨骼肌细胞 Vimentin的表达，其含量的升高和降低反映损伤的骨骼肌在不同的病理阶段 Vimentin表达程度的变化，可作为反映了肌肉损伤和再生变化情况的量化指标。本研究结果表明，补充VE能有效地减少离心运动所引起的骨骼肌肌纤维损伤的形态学改变。

一般认为，VE具有抗氧化作用，同时也能促进蛋白质的合成等功能〔8〕。李世成等〔9〕通过补充大豆对细胞骨架蛋白影响的角度来研究，结果发现高强度离心运动后出现结蛋白抗结蛋白抗体染色脱染的现象，其脱染细胞百分数以运动后12 h最高；而波形蛋白不同程度的抗波形蛋白抗体染色阳性的现象，其阳性细胞百分数以运动后24 h最高；而补充大豆分离蛋白可减轻骨骼肌细胞抗结蛋白染色脱染的现象，并增加 Vimentin的表达，说明大豆蛋白可维持结蛋白的完整性，减轻运动性骨骼肌微细损伤。大豆蛋白含有活性肽，与VE同属抗氧化剂，其减轻运动性骨骼肌损伤的作用应该是一致的。本研究的VE能有效地减少骨骼肌肌纤维损伤形态学改变的结果，可能缘于VE的抗氧化和促进蛋白质合成的功能，而后者还需进一步的研究加以确认。

4 参考文献

1马 涛，李世昌.细胞骨架及运动性骨骼肌微损伤研究进展〔J〕.体育学刊，2006;13(5)：48-52.

2段立公，李国平，李肃反.结蛋白和波形蛋白在运动性肌肉损伤和再生过程中表达及意义的实验研究〔J〕.中国运动医学杂志，2001;20(2)：167-70.

3Bornemann A，Schrnalbruch H.Desmin and vimentin in regenerating muscles〔J〕.Muscle Nerve,1992;15(1)：14-20.

4曹国华,陈吉棣.运动、营养与自由基代谢:游泳对小鼠肝脏组织内自由基代谢的影响〔J〕.中国运动医学杂志,1990;9(3):149-51.

5Higuchi M,Cartier LJ,Chen M,etal.Superoxide dismutase and catalase in skeletal muscle adaptive response to exercise〔J〕.J Gerontol,1985;40(3):281-6.

6余 斌，覃承诃，罗吉伟，等.抗氧化维生素对大鼠运动能力的影响〔J〕.第一军医大学学报，2003;23(9):892-4.

7Beaton LJ,Allan DA,Tarnopolsky MA,etal.Contraction-induced muscle damage is unaffected by vitamin E supplementation〔J〕.Med Sci Sports Exerc,2002;34(5):798-805.

8林文弢.运动生物化学〔M〕.北京:人民体育出版社，1999:39-43.

9李世成，焦海舟,王启荣,等.补充大豆蛋白对大鼠离心运动后骨骼肌细胞骨架Desmin 和Vimentin 的影响〔J〕.西安体育学院学报，2006;23(5)：68-71.