nTreg对DC和CIK细胞疫苗治疗黑色素细胞瘤小鼠的影响

任鹏涛 张 苑 闫庆辉 张国建 林 林 赵 晶

(河北医科大学第二医院肛肠外科，河北 石家庄 050000)

目前肿瘤的治疗手段多种多样，其中肿瘤的生物治疗已成为手术、放疗、化疗三大常规模式的有益补充〔1〕。生物治疗中的过继性细胞免疫疗法(ACI)是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的〔2〕。近期研究发现去除调节性T细胞(Treg)中自然发生的Treg(nTreg)细胞可以提高机体的抗肿瘤作用，所以寻找既能增强效应性免疫细胞抗肿瘤作用又能抑制Treg细胞作用的方法，将成为改善免疫治疗的新策略。本文以树突细胞(DC)和细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)疫苗治疗黑色素细胞瘤小鼠，探讨该疫苗对荷瘤小鼠nTreg的影响，评价nTreg在DC和CIK细胞疫苗治疗中的作用。

1 材料与方法

1.1动物模型建立 体外培养黑色素细胞瘤细胞株，将黑色素细胞瘤细胞注入C57 BL/6小鼠的皮下，制备小鼠的黑色素瘤动物模型。

1.2DC和CIK细胞疫苗 无菌状态下采集C57BL/6小鼠脾脏，碾碎后制备脾脏细胞悬液并按照文献〔3〕制备DC，在1640培养液中37℃培养2 h，并用RPMI1640培养液清洗2次，然后加入1640培养液继续培养16 h，收集非贴壁细胞即为DC细胞。培养黑色素瘤细胞，超声破碎后经12 000 r/min离心，取上清用0.22 μm过滤除菌，配置成1 000 ng/ml的蛋白液，按照1∶1体积与上述制备的DC细胞混合，37度孵育4 h备用。将DC浓度调整至105/L，同时加入相同体积的109/L T淋巴细胞，并且加入白细胞介素(IL)-2 5×105U/L，培养7 d后收获后即位CIK细胞，具有可杀伤肿瘤细胞活性。按照如下操作制备CIK细胞： 第1组：将小鼠脾脏细胞悬液应用免疫磁株分选的方法，去除nTreg细胞后，再用已制备的黑色素细胞瘤特异性DC疫苗进行共培养，制备肿瘤特异性的CIK效应细胞。第2组：未删除Treg细胞的T细胞，直接应用DC诱导脾脏T细胞形成肿瘤特异性的CIK效应细胞。第3组：未删除Treg细胞的T细胞，直接应用DC诱导脾脏T细胞形成肿瘤特异性的CIK效应细胞后，再应用免疫磁株分选的方法，去除Treg细胞。

1.3治疗方法 将负荷第一步建立的黑色素瘤C57BL/6小鼠的动物模型，应用Co60照射达到非髓性淋巴细胞删除(NMLD)状态。于体内低淋巴细胞血症的选定状态下回输DC疫苗以及第三步制备的效应细胞到C57BL/6荷瘤小鼠体内。分成治疗A组(输入删除nTreg的DC和CIK疫苗)、治疗B组(输入未删除nTreg的DC和CIK疫苗)、治疗C组(输入DC和CIK疫苗制备好后删除nTreg的疫苗)和对照组(造模且输入生理盐水)各10只，并以10只未造模的小鼠为空白组(不造模且输入生理盐水)。

1.4评价方法

1.4.1体外肿瘤杀伤实验 取培养的黑色素瘤细胞株作为靶细胞，接种于96孔板中培养24 h，根据肿瘤细胞浓度，按照20∶1的数量比加入100 μl三种方法制备的CIK细胞，另外设置单独CIK细胞和单独肿瘤细胞孔，每孔3个复孔，培养24 h。吸去上层100 μl液体，加入20 μl 0.5%的四甲基噻唑蓝混匀后，37℃孵育4 h后，加入100 μl二甲基亚砜，混匀、震荡，室温放置10 min后，在酶标仪上检测，检测波长492 nm，参考波长为650 nm。根据杀伤活性(%)=〔(1-实验组吸光值)/单独肿瘤细胞组吸光值〕×100% 计算各组的CIK的杀伤活性。

1.4.2肿瘤大小测量 用游标卡尺测量肿瘤直径，按公式(长径乘以短径的平方)除以2作为评价肿瘤大小的指标。分别测量治疗1、3、6、8、12 d时小鼠肿瘤大小。

1.4.3小鼠生存情况 分别统计各组大鼠在30 d内的生存情况，绘制生存曲线。

1.4.4细胞因子检测 分别在治疗前和治疗后3、8 d对小鼠进行断尾取血，取出的血液首先经过37℃孵育，使其充分血凝，然后2 500 r/min离心20 min，取上清，进行IL-2和IFN-γ检测。所有试剂盒为：鼠IL-2 ELISA Kit(GenStar,C702-01);鼠IFN-γ ELISA Kit ( Genstar,C707-01 )。

2 结 果

2.1体外杀伤结果 第1组制备的DC和CIK疫苗杀伤黑色素瘤细胞活性最强，平均杀伤活性为(98.32±6.24)%，显著高于第2组(45.53±9.13)%和第3组(51.27±8.24)%(t=8.22 ,P=0.004;t=7.88,P=0.004)。

2.2五组治疗后肿瘤大小变化情况 对照组小鼠肿瘤体积显著升高，治疗B和C组在第8、12天肿瘤生长被抑制，治疗A组在第6天肿瘤被抑制，第8、12天肿瘤大小显著降低。见图1。

图1 肿瘤大小变化情况(mm)

2.3各组生存情况 对照组小鼠在30 d内全部死亡，治疗A组仅在第3、6天分别死亡1只，治疗B组30 d内有5只存活，治疗C组30 d有3只存活，均显著高于对照组(χ2=1.327,P=0.001；χ2=21.214,P=0.031；χ2=16.193,P=0.024)。见图2。

图2 五组小鼠生存情况

3 讨 论

本研究结果说明nTreg会抑制 DC和CIK疫苗杀伤肿瘤细胞活性以及治疗肿瘤疗效。近几年，有关Treg在免疫系统中的作用一直是科学家们关注的热点课题。研究发现将去除了Treg细胞成分的T细胞注入裸鼠体内会引发多种的自身免疫性疾病，但如果注入Treg细胞却可以抑制这些疾病的发生；体外研究也证实Treg具有免疫抑制功能。随着人们对Treg细胞研究的深入发现在肿瘤微环境中Treg细胞数量升高且具有抑制肿瘤免疫的效应，这对于肿瘤疫苗的发展是一个重要障碍。CIK就是其中一种新型的免疫活性细胞，它是将外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点，从而成为ACI过程中的研究热点。但在实践中许多肿瘤免疫治疗方法仅能诱导微弱且短暂的免疫应答，不能产生长期、有效的抗肿瘤治疗作用。有关DC和CIK细胞疫苗疗效的报道很多，且已经应用于临床。陈海飞等〔4〕用DC-CIK细胞疫苗治疗34例晚期非小细胞癌患者，可缓解癌症进展，控制率为67.6%。侯彩妍等〔5〕探讨了DC-CIK疫苗的安全性，仅有部分患者出现发热反应。夏禾爱等〔6〕的结果也表明DC-CIK疫苗可逆转恶性肿瘤患者免疫抵御能力，从而达到一定的疗效，郭杰等〔7〕也在直肠癌化疗治疗中应用DC-CIK。

刘爱华等〔8〕研究了Tregs对DC-CIK治疗移植瘤胃癌活性的影响，结果得出删除CD4(+)CD25(+)Treg制备的DC-CIK细胞疫苗抗肿瘤活性会显著高于未删除CD4(+)CD25(+)Treg制备的DC-CIK细胞疫苗的活性。本文的结果与刘爱华的结果一致，从体外杀伤、抑制肿瘤大小和小鼠生存情况三个方面评价。虽然如此，文章未评价哪种类型的Treg发挥作用，究竟是nTreg还是活化后的Treg发挥抑制作用以及是通过何种机制发挥作用。下一步的工作将针对上述问题进行研究分析，从机制上明确Treg在DC-CIK疫苗中的作用。

4 参考文献

1劳贤邦,潘 玲.恶性肿瘤病人术后化疗的观察及护理体会〔J〕.广西医学,2009;31(6):910-1.

2Fry TJ,Mackall CL.T-cell adoptive immunotherapy for acute lymphoblastic leukemia〔J〕.Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2013;20(13):348-53.

3焦庆防,易发平,陈 全,等.树突状细胞疫苗的制备及其体外诱导细胞毒性T淋巴细胞对宫颈癌CaSki细胞的杀伤作用〔J〕.肿瘤,2011;31(2):106-10.

4陈海飞,沈红石,王 静,等.DC-CIK细胞的生物学活性及体外抗血液肿瘤研究〔J〕.现代生物医学进展,2012;12(30):5823-6.

5侯彩妍,徐丽丽,吴 琼,等.DC-CIK细胞治疗恶性肿瘤的感染因素分析〔J〕.中华医院感染学杂志,2013;23(13):3126-7.

6夏禾爱,郝建峰,陈 玲,等.DC-CIK细胞的制备及其对恶性肿瘤的疗效观察〔J〕.现代肿瘤医学,2013;21(10):2194-7.

7郭 杰,崔 海,朴素宙,等.CIK细胞联合DC细胞过继性免疫治疗结直肠癌化疗患者免疫功能的影响〔J〕.中国现代医学杂志,2013;23(10):32-5.

8刘爱华,张春艳,刘兴田,等.应用移植瘤胃癌模型探讨Tregs对DC-CIK细胞抗肿瘤活性的影响〔J〕.泰山医学院学报,2012;33(9):647-50.