马齿苋多糖对雏鸡免疫功能的影响

杨志敏，葛 剑，王运涛，杨翠军，刘建成 ，王文涛

(1.张家口市农业科学院，河北 张家口 075000； 2.河北北方学院，河北 张家口 075000；3.张家口学院，河北 张家口 075000)

随着生物医药等学科的飞速发展，天然多糖以其抗氧化、促免疫、抗肿瘤、消炎、抗病毒及高效低毒等特性越来越引起人们的关注[1，2]。马齿苋(Portulacaoleracea)为马齿苋科植物马齿苋的全草，含有氨基酸、维生素等多种营养成分及L-去甲肾上腺素、多巴明、黄酮类和多糖等生物活性物质。马齿苋多糖(Portulacaoleraceapolysaccharide，POP)是马齿苋的主要有效成分之一，临床研究认为，POP具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂以及免疫增强作用[3-11]。目前,有关POP在养殖业上的应用研究较少，试验采用POP口腔灌注雏鸡，观察其对雏鸡法氏囊免疫功能的影响，以期揭示POP免疫调节的机理，为马齿苋多糖在畜禽养殖上的应用提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

试验采用流式细胞仪(BD FACSAria，美国)；试剂为淋巴细胞分离液，PE(苯肾上腺素)荧光标记小鼠抗鸡CD4、CD8抗体、碘化丙啶、ConA均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 试验动物

试验用1日龄雏鸡均由河北北方学院牧业研究所提供，3层笼养育雏，采用正大蛋雏鸡料饲喂，自由采食和饮水。

1.3 马齿苋多糖的提取

采新鲜马齿苋全草，经50 ℃烘干，粉碎，依次利用石油醚、80%乙醇脱去脂肪和小分子糖类，利用水提取法提取POP，再利用95%乙醇沉淀，离心，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，经真空干燥制得马齿苋粗多糖，利用苯酚硫酸法测定多糖含量。

1.4 动物试验方法

选取1日龄健康蛋雏鸡80只，随机分为4组，分别为1个空白对照组(Ⅰ)和3个马齿苋多糖试验组，即试验Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ(POP剂量25，50和100 mg/kg)组，每组20只鸡，马齿苋多糖经雏鸡口腔灌服，每天1次，连续20 d，对照组灌服等量生理盐水。试验鸡饲喂相同基础日粮，自由采食和饮水。

1.5 免疫功能检测

试验结束后每组试验鸡无菌采血，EDTA抗凝，分离淋巴细胞，加入荧光标记的CD4、CD8抗体，利用流式细胞仪进行检测，Cell Quest软件分析T淋巴细胞亚群百分率；取血后全部剖杀，并无菌摘取法氏囊，准确称量湿重，计算法氏囊指数；随后取适量法氏囊组织块，利用机械法制备细胞样品，即取组织块在200目的铜网上搓，并用PBS向下冲洗细胞，离心收集细胞，经400目网过滤，PBS洗涤制成单细胞悬液，调整细胞数为1×106个，碘化丙啶综合染液染色30 min，用流式细胞仪进行检测，采用Medifit软件分析处于静止期(G0/G1期)、DNA合成期(S期)、分裂期(G2/M期)的细胞数量百分比，计算细胞增殖指数(PI)。

PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%

1.6 数据统计分析

所有数据采用SPSS 11.0进行分析处理，不同剂量采用多重比较，差异P<0.05为差异有统计学意义，结果均以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 POP对雏鸡外周血T淋巴细胞亚群及法氏囊指数的影响

不同浓度的POP作用于雏鸡，均能不同程度地提高雏鸡外周血中T淋巴细胞亚群细胞数量，并显著提高雏鸡法氏囊指数(P<0.05)(表1)。其中，CD4+T淋巴细胞数量以50 mg/kg POP试验组最高为38.47%，显著高于空白对照组及25 mg/kg组(P<0.05)，与100 mg/kg组差异不明显(P>0.05)；CD8+T淋巴细胞数量随POP浓度的升高也有增加的趋势，但不同浓度的POP组之间差异不显著(P>0.05)；CD4+/CD8+以试验Ⅲ组最高，为1.98，显著高于其他组(P<0.05)。法氏囊指数随POP浓度升高呈先高后低趋势，在50 mg/kg浓度上达到最高值。

表1 PDP对雏鸡外周血T淋巴细胞亚群和法氏囊指数的影响

注：同行字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)，下表同

2.2 POP对雏鸡法氏囊淋巴细胞周期及增殖指数的影响

法氏囊淋巴细胞周期的变化随POP用药剂量的增加，G0/G1期细胞数量逐渐降低，均显著低于对照组(P<0.05)，但不同浓度的POP试验组间差异不显著(P>0.05)；S期细胞数随POP浓度的升高逐渐增加，其中，100 mg/kg组达到最高，为8.20%，显著高于其他组别；G2/M期细胞数量在50 mg/kg组达到最高值，为6.32%，显著高于空白对照组及试验Ⅱ组(P<0.05)，与试验Ⅳ组差异不显著(P>0.05)。其中，法氏囊内的细胞数量以G0/G1期为主，占85.97%～91.70%。法氏囊增殖指数(PI)以100 mg/kg组最高，显著高于对照及试验Ⅱ组(P<0.05)，与50 mg/kg 组无明显差异(P>0.05)。

表2 POP对雏鸡法氏囊淋巴细胞周期及增殖指数的影响

3 讨论与结论

有关马齿苋多糖免疫活性的调节大多集中在小鼠上，对畜禽免疫能力的影响报道较少。研究结果表明，随着马齿苋多糖浓度增加，雏鸡外周血中CD4+T淋巴细胞数量显著增加，CD8+T淋巴细胞水平在不同浓度的POP组之间变化不明显，CD4+/CD8+比值显著增加。而T淋巴细胞直接参与机体的免疫应答，当机体受外界刺激，可使体内T淋巴细胞的数量和免疫活性发生改变，尤其是CD4+T和CD8+T淋巴细胞水平，CD4+T淋巴细胞具有诱导和增强机体免疫应答的作用，CD8+T淋巴细胞主要介导细胞毒杀伤作用，在正常范围内，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值升高提示提示正相免疫调节占优势。试验结果与李淑芳等[12]报道米糠多糖能够提高健康雏鸡外周血CD4+T淋巴细胞比率，对CD8+T淋巴细胞作用不明显的结论相似。马齿苋多糖可直接作用于T淋巴细胞，通过增加CD4+T淋巴细胞数量，提高CD4+/CD8+T淋巴细胞比值，增强免疫力。

法氏囊是家禽的中枢免疫器官，测定法氏囊指数能反映机体的防御免疫功能。试验在不同浓度梯度的马齿苋多糖均能提高雏鸡法氏囊指数，与魏炳栋等[13]和王关林等[14]的研究结果相近，说明适宜的多糖浓度能有效刺激法氏囊的发育，提高机体主动免疫能力。

试验中，不同浓度梯度的POP均能增加法氏囊DNA合成期(S期)的淋巴细胞数量，不同程度地降低静止期(G0/G1期)淋巴细胞数量，提高分裂期(G2/M期)的淋巴细胞数量，从而有效提升法氏囊淋巴细胞增殖指数。这与刘华等[15]报道的防风多糖能促进小鼠淋巴细胞的增殖效果相似。试验POP可能通过提高细胞分裂和DNA合成，促进淋巴器官发育，提高机体免疫功能。

马齿苋多糖可提高雏鸡外周血T淋巴细胞亚群CD4+T淋巴细胞数量和CD4+/CD8+T淋巴细胞比值，显著提高雏鸡法氏囊指数，并通过提高法氏囊细胞分裂和DNA合成，促进淋巴器官发育，提高机体免疫功能，为提高幼龄动物免疫力，开发绿色无公害饲料添加剂提供了参考依据。

参考文献:

[1] 付书婕,王乃平,黄仁彬.植物多糖免疫调节作用的研究进展[J].时珍国医国药,2008,19(1):99-101.

[2] YANG X P,GUO D Y,ZHANG J M,etal.Characterization and antitumor activity of pollen polysaccharide[J].International Immunopharmacology,2007(7):427-434.

[3] 崔旻,尹苗,安利国,等.马齿苋多糖的抗肿瘤活性[J].山东师大学报,2002,17(1):73-76.

[4] 王晓波,刘殿武,丁月新,等.马齿苋多糖对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能作用[J].中国公共卫生,2005,21(4):462-463.

[5] 王晓波,姜红,王本华,等.马齿苋多糖对肿瘤细胞的体内外抑制作用[J].中国公共卫生,2005,21(12):1485-1486.

[6] LU X H,HE J S,ZHU X Z.Immune effects of polysaccharide from Portulaca oleracea on mice[J].Pharmacol Clin Chin Mater Med,2006,22(3,4):89-90.

[7] DUAN Y F,HAN G P.Study on separating and antioxidative activity of polysaccharides extrated from Portulaca oleracea L.[J].Food Sci,2005,26(3):225-228.

[8] 李小兰，周爱国．马齿苋多糖对衰老模型小鼠的抗衰老作用[J]．中国老年学杂志，2009，29(21)：2778-2780．

[9] 刘华，李玉萍，周春丽，等．马齿苋多糖对前脂肪细胞的抑制作用及体外抗氧化研究[J]．食品科技，2010，35(9)：233-235．

[10] 潘锋，张涛，陈建永.马齿苋多糖干预大鼠溃疡性结肠炎Caspase-3 Caspase-8表达的研究[J]．中华中医药学刊，2010，28(8)：1639-1641．

[11] 孙黎，杨翠军，葛剑，等．马齿苋多糖对雏鸡脾脏免疫功能的影响[J]．黑龙江畜牧兽医，2010(11)：137-138．

[12] 李淑芳,李英,张继东,等.米糠多糖对不同免疫状态雏鸡外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的影响[J].河北农业科学,2008,12 (5):74-76.

[13] 魏炳栋,于维,陶浩,等.黄芪多糖对1～14日龄肉仔鸡生长性能、脏器指数及抗氧化能力的影响[J].动物营养学报,2011,23(3):486-491.

[14] 王关林,宋扬,罗红梅.莪术多糖对雏鸡抗氧化能力和免疫功能的影响[J].畜牧兽医学报,2006,37(11):1184-1188.

[15] 刘华,田嘉铭,孙黎,等.正常小鼠巨噬细胞及外周血淋巴细胞亚群对防风多糖干预的反应[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(18):3475-3478.