肝豆灵对Wilson病模型大鼠肝组织miRNA-122表达的影响

沈 斌，鲍远程，蒋怀周，张 娟，王艳昕，方 向

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；2.安徽中医药大学第一附属医院脑病中心，安徽 合肥 230031；3.安徽中医药大学中医临床学院，安徽 合肥 230038)

肝豆灵对Wilson病模型大鼠肝组织miRNA-122表达的影响

沈 斌1，鲍远程2，蒋怀周3，张 娟2，王艳昕2，方 向2

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；2.安徽中医药大学第一附属医院脑病中心，安徽 合肥 230031；3.安徽中医药大学中医临床学院，安徽 合肥 230038)

目的研究肝豆灵对Wilson病(Wilson’s disease, WD)大鼠肝组织miRNA-122表达的影响，探究其保护肝脏的机制。方法将24只Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型组、青霉胺组和肝豆灵组。铜负荷喂养8周后，分别用青霉胺、肝豆灵以成人等效剂量灌胃，空白对照组及模型组均以等量生理盐水灌胃，每组均灌胃4周。观察各组大鼠肝功能及肝组织miRNA-122的表达水平。结果肝豆灵和青霉胺均可显著降低WD大鼠异常升高的血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(total bilirubin，TBil)(P<0.05，或P<0.01)，显著升高WD大鼠肝组织异常降低的miRNA-122表达水平(P<0.01)。肝豆灵降低血清ALT、AST和TBil的作用及升高肝组织miRNA-122表达的作用显著优于青霉胺(P<0.05，或P<0.01)。结论肝豆灵保护WD大鼠肝功能的作用与其上调肝组织miRNA-122的表达有关。

肝豆状核变性；肝豆灵；青霉胺；miRNA-122

肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration，HLD)，又称Wilson病(Wilson disease，WD)，是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病。在WD临床病程中，以肝脏损害表现最为常见，首发症状中也最为多见。笔者在运用肝豆灵片治疗WD的过程中，发现其对肝脏具有保护作用。因此，笔者通过复制WD大鼠模型，探究肝豆灵的保肝作用机制，以期为临床防治WD患者肝损害提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 实验用清洁级Wistar大鼠24只，雌性，月龄均为3个月，平均体质量(200±20)g，购于安徽医科大学实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK(皖)2013-01。动物房为普通级饲养室，实验前先适应性饲养1周后，随机数字表法分为4组，每组6只，分别为空白对照组、模型组、青霉胺组、肝豆灵组。

1.2 仪器 ASCA全自动生化分析仪：美国Microgenics仪器公司；HH-W21-600型电热恒温水浴箱：上海医用恒温设备厂；FA2004型电子天平：上海天平仪器厂；XK96-B混匀器：江苏姜堰新康仪器厂；101-A恒温干燥箱：宁波自动化仪表厂；洁净工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；9700型基因扩增仪：美国Applied Biosystems公司；引物设计软件：Primer 5.0；ViiA 7实时荧光定量PCR系统：美国Applied Biosystems公司。

1.3 试剂 硫酸铜(批号 201203)：中科铜都粉体新材料股份有限公司；TRIzol试剂(P/N15596-018)：美国Invitrogen公司；反向引物：上海百力格生物技术有限公司；PCR引物：由上海康成生物有限公司合成；试剂为国产分析纯，武汉康盛医药科技有限公司产品。

1.4 试验药物 肝豆灵由安徽中医药大学第一附属医院制剂室提供(批号为皖药制字Z20050071)，每盒150片，每片0.3 g，主要由石菖蒲、丹参、姜黄、莪术、郁金、黄连、大黄、金钱草等药物组成。

2 方法

2.1 模型复制 从实验第1天开始，除空白对照组予以普通饲料，其余3组均参照文献[1]复制铜负荷大鼠模型，即予含硫酸铜1.0 g/kg的饲料和0.185%硫酸铜的水，喂养12周；各组大鼠每天自由进食并自由饮水。

2.2给药方法

2.2.1 肝豆灵组：从第7周第1天开始，每日每只大鼠按0.486 g/kg将肝豆灵溶于生理盐水予以灌胃，每日1次，共6周。

2.2.2 青霉胺组：从第7周第1天开始，每日每只大鼠予以青霉胺0.09 g/kg，每日1次，共6周。

2.2.3 空白对照组和模型组：给予等容量生理盐水，连续6周。

2.3 标本留取 各组动物在第13周实验结束后，禁食12 h，处死动物。乙醚麻醉，腹主动脉取血进行肝功能生化检测。取肝组织液氮速冻后存于-80 ℃冰箱，用于miRNA-122检测。

2.4 肝功能检测 血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)和总胆红素(total bilirubin，TBil)由全自动生化分析仪测定。

2.5 RNA提取 采用TRIzol法提取RNA。每50～100 mg组织样品，加入1 mL TRIzol试剂，用电动匀浆器进行匀浆。所加样品体积不能超过匀浆此样品所使用的TRIzol试剂体积的10%。按照RecoverAllTM总核酸提取试剂盒(Ambion， Austin)的操作说明书，从组织悬液中提取总RNA。紫外分光光度计用于评估RNA的浓度和纯度。将所有RNA样品置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.6 miRNAs反转录和实时荧光定量RT-PCR扩增 ①cDNA的合成：RT混合反应液由2 μL dNTP、2 μL 10×RT Buffer、0.3 μL RT特异引物、1 000 ng总RNA、0.1 μL MMLV反转录酶、0.3 μL RNA酶抑制剂组成，加无RNA酶水至20 μL。②RT-PCR反应：在9700型基因扩增仪中进行，16 ℃ 30 min，42 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。反应结束后，将其放在冰上待用或-20 ℃保存。实时荧光PCR反应采用美国Life Technologies公司的ViiA 7实时荧光定量PCR反应体系。体系配置中有5 μL 2×Master Mix、0.5 μL 10 μmol/L的PCR特异引物F、0.5 μL 10 μmol/L的PCR特异引物，引物序列见表1，最后加双蒸水至8 μL。②实时PCR反应条件为：95 ℃，10 min；40个PCR循环(95 ℃，10 s；60 ℃，60 s)。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按照“95 ℃，10 s→60 ℃，60 s→95 ℃，15 s”的顺序控制反应温度，并从60 ℃缓慢加热到99 ℃(每秒升高0.05 ℃)。各样品的目的miRNA和内参(U6)分别进行实时定量PCR反应。数据采用2-ΔΔCT法进行分析。

表1 实时定量PCR使用引物列表

3 结果

3.1 各组大鼠肝功能比较 与空白对照组比较，模型组ALT、AST、TBil水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，青霉胺组和肝豆灵组ALT、AST、TBIL水平显著降低(P<0.01)；肝豆灵组ALT、AST和TBIL水平显著低于青霉胺组(P<0.05，或P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠肝功能指标比较

注：与空白对照组比较，△△P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与青霉胺组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 各组大鼠肝组织miRNA-122表达水平比较 与空白对照组比较，模型组miRNA-122表达水平显著降低(P<0.01)，与模型组比较，青霉胺组、肝豆灵组miRNA-122表达水平显著升高(P<0.05，或P<0.01)；肝豆灵组miRNA-122表达水平显著高于青霉胺组(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肝组织miRNA-122表达水平比较

注：与空白对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与青霉胺组比较，*P<0.05。

4 讨论

目前临床常采用ALT和AST作为肝损伤的标记物，这两种转氨酶在人体多个组织中均有分布，缺乏特异性[2]。在病毒性肝炎、脂肪肝、药物性肝炎、肝癌、酒精性肝炎等肝脏疾病中，ALT因肝细胞损伤或通透性增加，释放入血引起血液中ALT升高。WD模型大鼠因铜过量沉积引起肝组织破坏，ALT升高。肝特异性miRNA-122作为首个临床药物受到越来越多的关注[3]，miRNA-122可能参与了肝脏的发育分化[4]，在维持肝脏的正常功能代谢上起着重要的作用[5-6]，在目前常见的肝脏疾病(如病毒性肝炎、肝癌、肝硬化)中起到了很重要的调控作用[7-10]。一些研究发现血浆miRNA-122水平与ALT水平呈正相关关系，且升高的时间段更早，推测ALT可作为肝损伤的早期标志物[10]。

前期大量的基础和临床研究[12-14]发现，WD肝损伤的基本病机为湿热内蕴、痰瘀互结，具有通腑利尿、化瘀散结作用的中药专方肝豆灵片，可以改善WD患者的肝功能指标。肝豆灵片以石菖蒲、丹参为君药，石菖蒲辟秽开窍、宣气逐痰；丹参专入血分，内达脏腑，能化瘀滞，与丹参共奏祛痰化瘀之功。姜黄破血行气、通经止痛；莪术行气破血、消积止痛；郁金行气化瘀、清心解郁、利胆退黄。三药合用软坚散结，共为臣药。大黄泻热通腑、凉血解毒、逐瘀通经，《日华子本草》谓大黄“通宣一切气，调血脉，利关节，泄壅滞、水气，四肢冷热不调，温瘴热痰，利大小便，并敷一切疮疖痈毒”。黄连泻火解毒、清热燥湿。大黄、黄连共为佐药，奏清热通腑之功。金钱草利水通淋、清热解毒、散瘀消肿，又可引诸药入肝胆经，为使药。纵观全方，肝豆灵不仅以通腑利湿之法促进铜毒的排出，同时佐以化痰散结之法以治“积聚”“癥瘕”，标本同治。

本研究结果表明，WD模型大鼠血清ALT、AST、TBil显著升高，肝豆灵可显著降低异常升高的ALT、AST和TBIL，同时肝豆灵能够提高肝组织中miRNA-122的表达水平。结果提示，肝豆灵改善肝功能的机制可能与上调肝组织中miRNA-122的表达有关。

[1]Pulverer BJ，Kyriakis JM，Avruch J，et al. Phosphorylation of c-jun mediated by MAP kinases[J].Nature，1991，353(6345)：670-674.

[2]俸家富，涂植光.肝功能相关的血清酶学研究进展[J].医学综述，2007，13(3)：225-230.

[3]Young DD，Connelly CM，Grohmann C，et al. Small molecule modifiers of microRNA miR-122 function for the treatment of hepatitis C virus infection and hepatocellular carcinoma[J].J Am Chem Soc，2010，132(23)：7976-7981.

[4]Gao Y，He Y，Ding J，et al. An insertion/deletion polymorphism at miRNA-122-binding site in the interleukin-1α 3′ untranslated region confers risk for hepatocellular carcinoma[J].Carcinogenesis，2009，30(12)：2064-2069.

[5]Bhattacharyya SN，Habermacher R，Martine U，et al. Relief of microRNA-mediated translational repression in human cells subjected to stress[J].Cell，2006，125(6)：1111-1124.

[6]Girard M，Jacquemin E，Munnich A，et al. miR-122，a paradigm for the role of microRNAs in the liver[J].J Hepatol，2008，48(4)：648-656.

[7]Díaz-Toledano R，Ariza-Mateos A，Birk A，et al.Invitrocharacterization of a miR-122-sensitive double-helical switch element in the 5′ region of hepatitis C virus RNA[J].Nucleic Acids Res，2009，37(16)：5498-5510.

[8]Chen Y，Shen A，Rider PJ，et al. A liver-specific microRNA binds to a highly conserved RNA sequence of hepatitis B virus and negatively regulates viral gene expression and replication[J].FASEB J，2011，25(12)：4511-4521.

[9]Wang S，Qiu L，Yan X，et al. Loss of microRNA 122 expression in patients with hepatitis B enhances hepatitis B virus replication through cyclin G1-modulated P53 activity[J].Hepatology，2012，55(3)：730-741.

[10]Karakatsanis A，Papaconstantinou I，Gazouli M，et al. Expression of microRNAs，miR-21， miR-31，miR-122，miR-145，miR-146a，miR-200c，miR-221，miR-222，and miR-223 in patients with hepatocellular carcinoma or intrahepatic cholangiocarcinoma and its prognostic significance[J].Mol Carcinog，2013，52(4)：297-303.

[11]李祥云，陈兆军，潘峰，等.Micro-RNA-122在不同时期慢性乙肝患者外周血浆中表达变化的研究[J].中国卫生检验杂志，2013，23(4)：874-876.

[12]杨文明, 韩辉, 鲍远程, 等. 中医对肝豆状核变性病因病机及辨证论治的探索[J]. 北京中医药大学学报: 中医临床版, 2012, 19(4): 6-9.

[13]杨文明, 鲍远程, 张波, 等. 肝豆状核变性诊疗方案[J]. 中医药临床杂志, 2012, 24(11): 1130-1131.

[14]汪瀚, 杨文明, 鲍远程. 从铜毒论治肝豆状核变性初探[J]. 安徽中医学院学报, 2009, 28(5): 4-6.

EffectofGandoulingonmiRNA-122ExpressioninLiverTissuesinRatModelofWilson’sDisease

SHENBin1,BAOYuan-cheng2,JIANGHuai-zhou3,ZHANGJuan2,WANGYan-xin2,FANGXiang2

(1.HubeiUniversityofChineseMedicine,HubeiWuhan430065,China; 2.EncephalopathyCenter,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 3.CollegeofClinicalChineseMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

ObjectiveTo study the effect of Gandouling on the miRNA-122 expression in liver tissues of rats with Wilson’s disease (WD) and to explore the action mechanism of Gandouling in liver protection.MethodsTwenty-four Wistar rats were randomly divided into blank control group, model group, penicillamine group, and Gandouling group. All rats except those in the blank control group were given copper-overloaded diets for 8 weeks. Then, the penicillamine group and Gandouling group

penicillamine and Gandouling, respectively, by gavage at human-equivalent doses, while the blank control group and model group received an equal volume of normal saline by gavage; intragastric administration was performed for 4 weeks in each group. The liver function and hepatic miRNA-122 expression in each group were measured.ResultsBoth Gandouling and penicillamine significantly reduced the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and total bilirubin (TBil) (P<0.05 orP<0.01), which were abnormally elevated in rats with WD, and significantly increased miRNA-122 expression (P<0.01), which was significantly reduced in the liver tissues of rats with WD. Gandouling was significantly superior to penicillamine in reducing serum ALT, AST, and TBil levels and increasing hepatic miRNA-122 expression (P<0.05 orP<0.01).ConclusionGandouling can protect the liver function of rats with WD, possibly by increasing hepatic miRNA-122 expression.

Wilson’s disease; Gandouling; penicillamine; miRNA-122

国家自然科学基金项目(81202691)

沈斌(1980-)，男，博士研究生，主治医师

鲍远程，1640748037@qq.com

R742.4；R285.5

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.017

2014-06-07)