针刀疗法对腰椎间盘突出症根性神经痛大鼠血清IL-1和IL-6的影响

朴起范，郭长青，付伟涛，于佳妮，梁楚西，张丽萍，崔成俊

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029)

针刀疗法对腰椎间盘突出症根性神经痛大鼠血清IL-1和IL-6的影响

朴起范，郭长青，付伟涛，于佳妮，梁楚西，张丽萍，崔成俊

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029)

目的观察针刀疗法对腰椎间盘突出症根性神经痛大鼠血清白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)和白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)含量的影响，探讨针刀疗法治疗腰椎间盘突出症根性神经痛的机制。方法将40只雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、针刀组，每组10只。采用非压迫性髓核突出模型，用热痛测试仪检测各组大鼠模型复制前后缩爪潜伏期；模型复制后第8天，采用双抗夹心ELISA法检测各组血清IL-1、IL-6含量。结果与正常组和假手术组比较，模型组缩爪潜伏期差值显著升高(P<0.01)；与模型组比较，针刀组缩爪潜伏期差值显著降低(P<0.01)。与正常组比较，模型组血清IL-1、IL-6含量明显增加(P<0.01)；与模型组比较，针刀组IL-1、IL-6含量明显减少(P<0.01)。针刀组大鼠神经根的髓鞘、轴突和雪旺细胞的病理变化较模型组明显减轻。结论针刀疗法减轻腰椎间盘突出症根性神经痛的机制与其降低血清炎性细胞因子IL-1和IL-6有关。

针刀疗法；腰椎间盘突出症；根性神经痛；IL-1；IL-6

腰椎间盘突出症是常见病和多发病，对患者日常生活和工作造成严重影响。大量的临床报道肯定了针刀治疗腰椎间盘突出症的疗效[1-3]，但其作用机制仍处于假设和论证阶段。本实验通过观察腰椎间盘突出症根性神经痛大鼠血清白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量的变化，探讨针刀疗法的外周镇痛机制。

1 材料

1.1 动物与分组 清洁级SD雄性健康大鼠40只，体质量(250±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号为SCXK(京)2001-0001。于北京中医药大学针灸推拿学院针灸机制实验室动物室中适应性饲养7 d后，将其随机分为正常组、假手术组、模型组、针刀组，每组各10只。

1.2 主要仪器 HZ系列一次性使用针刀(汉章针刀)：北京卓越华友医疗器械有限公司生产，规格为0.4 mm×40 mm；28号一次性无菌针灸针：华佗牌，苏州医疗用品厂有限公司生产，规格为0.35 mm×25 mm；骨科手术器械：含手术刀、剪、镊和钳；9号腰椎穿刺针：江苏省扬州市江洲医疗器械有限公司生产；低温离心机：德国Eppendorf公司，5810R型；MDF-U50A超低温冰箱：日本SANYO公司；AE160电子天平：瑞士METTLER公司；Thermo Multiskan MK3：芬兰。

1.3 主要试剂 大鼠IL-1、IL-6 ELISA测定试剂盒：北京瑞格博科技有限公司。

2 方法

2.1 模型复制方法 采用陆志东等[4]非压迫性腰椎间盘髓核突出症模型复制方法。

2.1.1 自体髓核混悬液的制备：术前1 d，大鼠背部用脱毛剂脱毛。10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉，无菌条件下距尾根部1 cm处切下鼠尾并缝合伤口。切开尾部椎间盘，见髓核呈胶冻样约10 mg，取5个髓核，按1 mg加入1 μL生理盐水配伍比例，充分搅拌稀释成混悬液备用。

2.1.2 具体操作方法：模型组：将大鼠腰椎置于屈曲侧卧位，以L4—5棘突间隙为穿刺点，用9号腰椎穿刺针行硬膜外穿刺，成功后注射20 μL大鼠自体髓核混悬液，接着将2%利多卡因30 μL注射到硬膜外腔。假手术组：麻醉、断尾、硬膜外穿刺同模型组，不同的是将20 μL生理盐水和2%利多卡因30 μL注射到硬膜外腔。针刀组复制方法同模型组。水合氯醛麻醉恢复后，大鼠四肢活动自如，说明硬膜外穿刺和注射失败。双前肢活动自如，双后肢运动、感觉丧失或减退，20～30 min后完全恢复，说明硬膜外穿刺注射成功。此时，可继续进一步观察其双下肢有无瘫痪(步态不稳或足外翻)以判定模型复制过程中是否对脊髓有损伤。若无瘫痪，则对其两侧后足进行热刺激痛觉过敏的检测，若热痛反应出现痛觉过敏，则提示模型复制成功。

2.2 干预方法 正常组正常饲养；假手术组和模型组均在模型复制后正常饲养。针刀组模型复制3 d后给予针刀干预。施针刀时首先用自制袜套将大鼠固定于鼠板上，以使其不能强烈挣扎为度。在L4—5棘间、L4—5棘间旁开0.1 cm处局部无菌操作，进行针刀操作，以大鼠下肢触电样抽动为度。每周治疗1次，共治疗1次。

2.3 取材 模型复制后第8天将各组大鼠分别固定于铡刀，在枕骨大孔水平断头处死。各组大鼠均采用断头后迅速倒置，离心管收集全血5 mL，4 ℃下静置3 h，置于离心机内离心(4 ℃，3 500 r/min，10 min)，离心后取上清，放于-20 ℃冰箱中保存待测。断头处死大鼠，采血后，从腹腔解剖入路暴露L5神经根，取长约2 mm的神经根组织，以10%甲醛浸泡固定，置于4 ℃冰箱中保存，以备切片观察。

2.4 观察指标

2.4.1 一般情况：从模型复制第1天开始，观察大鼠有无烦躁、撕咬肢体、频繁摇动尾巴、后肢或足突然自发抬起、用嘴反复舔后爪、食欲降低等反应。

2.4.2 后肢缩爪潜伏期的变化：后肢缩爪潜伏期的检测均于下午(13:00—18:00)进行，将各组大鼠置于PL-200型热痛测试仪的检测盒内，辐射热光源经底部玻璃板聚焦到一侧足底的后半部，光斑直径5 mm。记录从开始照射到产生缩爪的时间。每次测试间隔至少5 min，测量3次取平均值，两侧后足交替检测，根据平均值求出两后足的缩爪潜伏期，计算术前潜伏期与术后潜伏期的差值，差值显著大于正常大鼠则表明潜伏期降低，对热痛反应存在痛觉过敏。

2.4.3 血清IL-1和IL-6检测：采用双抗夹心ELISA法检测血清IL-1、IL-6，严格按照试剂盒说明书操作。

2.4.4 病理组织学观察： 将各组大鼠长约2 mm的L5神经根浸泡固定后，石蜡包埋，自神经根分叉近端开始切片，切片厚度为5 μm，脱蜡，苏木精-伊红(hemotoxylin-eosin, HE)溶液染色。常规脱水，中性树脂封片，光学显微镜下观察神经根的病理改变。

3 结果

3.1 一般情况 本次模型复制全部成功。模型大鼠活动减少，精神萎靡，多蜷缩于笼中一角，饮食、饮水较正常减少。自由活动时，行走速度变慢，步幅和频率减小，未出现撕咬肢体、频繁摇动尾巴、后肢或足突然自发抬起、用嘴反复舔后爪、食欲降低，而出现了易激惹、活动频繁的行为。

3.2 各组治疗前后缩爪潜伏期差值比较 与正常组和假手术组比较，模型组缩爪潜伏期差值显著增大(P<0.01)；与模型组比较，针刀组缩爪潜伏期差值显著减小(P<0.01)。见表1。

3.3 各组大鼠血清IL-1、IL-6水平比较 与正常组比较，模型组血清IL-1、IL-6水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，针刀组血清IL-1、IL-6水平明显降低(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠缩爪潜伏期差值及血清IL-1和IL-6比较

注：与正常组比较，**P<0.01；与假手术组比较，##P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01。

3.4 各组大鼠神经根组织形态学变化 正常组、假手术组神经组织结构致密、完整，有髓纤维的髓鞘完整、排列规则整齐，雪旺细胞大小均匀一致，数量较多，轴突表面规则完整，排列规则，无水肿。模型组有髓纤维的髓鞘不完整，排列不规则，雪旺细胞数量减少，轴突边缘模糊，大小不规则，出现水肿变形，排列稀疏，胞质内出现明显的空泡。针刀组出现新生的髓鞘，髓鞘整体排列规则，大小基本一致，轴突无水肿，排列整齐，雪旺细胞大小一致。见图1。

注：A.正常组；B.假手术组；C.模型组；D.针刀组。

图1各组大鼠右侧L5神经根组织形态学变化(HE染色，10×40倍)

4 讨论

目前大多数学者认为，根性神经痛的发生与腰椎间盘突出引起的机械性压迫因素及多种化学性炎性递质、免疫性炎性递质、细胞因子、神经源性炎性递质有关[6]。突出的椎间盘组织压迫神经根或神经根被牵伸是引起坐骨神经痛的原因，但是许多患者髓核和神经根之间的接触并没有机械压迫，也有明显的腰腿痛。本实验所建立的动物模型亦证实了这一点：将大鼠自体髓核移植到硬膜外腔，未出现运动障碍，排除了机械压迫因素后，大鼠活动频繁，易激惹，模型组大鼠模型复制前后热刺激缩爪潜伏期差值明显高于正常组和假模型组(P<0.01)，后肢出现明显的痛觉过敏反应，说明病理情况下髓核本身也能引起坐骨神经痛。组织形态学观察结果显示模型大鼠有髓神经纤维出现脱髓鞘改变、空泡样变性等病理改变，表明髓核本身的自身免疫炎性反应是引起根性神经痛的可能因素之一。

IL-1是一种细胞因子，属于白细胞介素的一种。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎性反应中起重要作用。腰椎间盘组织是人体最大的无血供组织，髓核被纤维环包裹与血液循环相隔离。当外伤或退行性病变导致椎间盘抗原成分与血液循环相接触后，能产生免疫反应[6]，释放多种炎性递质。近年来的研究证实了突出的髓核组织可以产生肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和IL-1β[7]，细胞因子和神经疼痛的关系因此受到了广泛的关注。Inoue A等[8]发现IL-1β通过促进背侧脊神经节释放P物质，传递初级传入神经的有害刺激信号，降低疼痛的阈值，从而造成痛觉过敏。暴露髓核的存在导致了各种生物化学因子的产生并通过各种途径引起邻近神经根的损伤和产生疼痛，这些因子间的相互作用及其在腰椎间盘突出症中具体的作用机制尚不完全清楚。Wehling等[9]采用IL-1受体拮抗剂能显著减轻脊神经根的过敏性炎性损伤，说明IL-1在神经根损伤中也起着重要作用。本研究结果显示，模型组大鼠活动频繁，易激惹，后肢出现明显的痛觉过敏反应，正是脊神经节受到有害刺激和损伤的表现。血清中IL-1的含量明显升高(P<0.01)，表明模型复制后由于髓核的免疫炎性反应促使机体释放IL-1等物质，引起了机体的痛觉过敏和痛反应。针刀干预后，血清中IL-1含量均较模型组显著降低(P<0.01)，说明针刀干预后，可减少外周IL-1的释放，减轻模型鼠的疼痛。这提示针刀疗法能显著改善腰椎间盘突出症根性神经痛的炎性反应，这为临床治疗提供了实验依据。

IL-6是具有多种生物学活性的细胞因子，也是机体复杂的细胞因子网络中的关键因子，它可以调节其他细胞因子的作用[10]。有研究表明，IL-6的血浓度与患者感染的严重程度以及炎性反应的程度呈正相关，可作为判断病情严重程度的灵敏指标[11-12]。IL-6在正常情况下调节免疫应答。IL-6不能刺激相应细胞分泌其他细胞因子，在生理浓度下对免疫细胞的自分泌作用亦比较弱，提示其主要免疫学功能是加强其他细胞因子的效果，而在病理状态下，其浓度的升高可引起免疫性的病理损伤[13]。IL-6是敏感反映机体炎症和组织损伤严重程度的重要指标[14]。IL-6是一种在损伤后协调系统性宿主防御反应中起重要作用的细胞因子，多在细胞受到TNF-α、IL-1β刺激后产生，本身对细胞无直接损害作用，能促进中性粒细胞的活化、聚集，与多种疾病的病理生理过程紧密相关，血清IL-6水平可反映组织损伤程度[15]。本实验结果显示，模型组大鼠血清IL-6的含量较正常组显著升高(P<0.01)，针刀干预后，血清IL-6含量均较模型组显著降低(P<0.05)。结果提示髓核与血液循环接触后，产生了免疫反应，并释放了炎性递质，也说明针刀干预后，可减少外周IL-6的释放，减轻模型大鼠的炎性反应。

针刀疗法将针刺疗法和手术松解法有机地结合为一体[16]，一方面利用针刺的作用，疏通气血、活血化瘀，“通则不痛”；另一方面利用刀的切割作用，松解粘连，解除卡压，“以松致通，通则不痛”。本实验证实针刀疗法可直接作用于腰椎间盘突出症大鼠的病变局部，松解局部黏连和挛缩，改善局部血液循环，并通过调节血清IL-1和IL-6含量，从而减轻髓核所致的外周炎性反应对机体的伤害性感受器的刺激作用，这可能是针刀疗法治疗腰椎间盘突出症根性神经痛的外周镇痛机制之一。

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EffectofAcupotomyonSerumInterleukin-1andInterleukin-6LevelsinRatswithRadicularPainDuetoLumbarDiscHerniation

PIAOQi-fan,GUOChang-qing,FUWei-tao,YUJia-ni,LIANGChu-xi,ZHANGLi-ping,CUICheng-jun

(SchoolofAcupunctureandMoxibustion,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

ObjectiveTo observe the effect of acupotomy on serum interleukin-1 (IL-1) and interleukin-6 (IL-6) levels in rats with discogenic radiculagia and to explore the possible mechanism of acupotomy in treating this disease.MethodsForty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group, sham-operation group, model group, and acupotomy group, with 10 rats in each group. A rat model of non-compressive nucleus pulposus protrusion was induced. A thermal pain tester was used to measure the hindpaw withdrawal latency (HWL) of each rat before and after the model was induced. On the 8th day after the model was induced, double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine serum IL-1 and IL-6 levels in each group.ResultsCompared with the normal group and sham-operation group, the model group had a significantly increased difference value of HWL (P<0.01); compared with the model group, the acupotomy group had a significantly reduced difference value of HWL (P<0.01). Compared with the normal group, the model group had significantly increased serum IL-1 and IL-6 levels (P<0.01); compared with the model group, the acupotomy group had significantly reduced serum IL-1 and IL-6 levels (P<0.01). Compared with the model group, the acupotomy group had ameliorated pathological changes in the myelin sheath, axon, and Schwann cells.ConclusionThe mechanism by which acupotomy relieves radicular pain due to lumbar disc herniation may involve reducing serum IL-1 and IL-6 levels.

acupotomy; lumbar disc herniation; radicular pain; interleukin-1; interleukin-6

北京中医药大学自主课题项目(0100605128)

朴起范(1987-)，男，硕士研究生

郭长青，guochangqing66@163.com

R681.5+5

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.015

2014-06-26)