燕麦散黑穗病菌冬孢子萌发条件研究

张玉霞，赵桂琴，姚 拓，王国基，马文文

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州 730070)

燕麦(Avenasativa)是一种抗逆性强、生产潜力较大、品质优良的世界性粮饲兼用作物，全世界已有42个国家种植燕麦，年种植面积约1 300万hm2，其中95%是皮燕麦。中国主要种植裸燕麦，年种植面积约为100万hm2，主要集中于我国华北、西北地区[1]。目前，燕麦制品的开发领域已经涉及到食品、化妆品、医药、油脂抗氧化剂等多方面，除常见食品燕麦片外，还有燕麦方便食品、燕麦糕点和燕麦乳饮料等[2]。

散黑穗病(Ustilago)是我国燕麦产区发生最普遍和严重的真菌性病害，主要为害花器，病株始终直立，根系不发达，分蘖很少，既降低了燕麦种子产量，也影响秸秆的产量和品质[3]。该病在华北、西北的一些省区，发病率通常超过10%，河北、山西、内蒙古、甘肃等省最高发病率曾达46%～90%。据不完全统计，内蒙古全区每年粮食产量损失2.5×107～3.5×107kg。1981年，河北省废保县燕麦散黑穗病的发病面积达2.14万hm2，占该县裸燕麦播种面积69.1%，其中，7 933 hm2发病率在10%～13%，全县粮食产量损失1.5×106kg[4]。

燕麦散黑穗病病菌(Ustilagoavenae)以厚垣孢子附着在燕麦种子表面或以菌丝潜伏在种子与颖壳之间甚至种皮内越冬，引起初侵染，土壤和肥料传播的可能性较小[5]。目前，燕麦散黑穗病已成为当前严重影响其产量和品质的主要病害，甚至成为了一种毁灭性病害。冬孢子能否良好地萌发是该病害能否发生的关键，了解其在自然环境中的萌发适宜条件，在燕麦生产中尽量避免为其散黑穗病菌冬孢子萌发提供相适应的条件，可有效防止该病害的发生。燕麦冠锈、叶锈及白粉病等均被大量研究[6]，但是，该病害病原菌冬孢子萌发条件报道较少。通过测定燕麦散黑穗病菌冬孢子在不同条件下的萌发率，确定其萌发条件，可为该病害科学防治提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试燕麦散黑穗病菌冬孢子由甘肃省农业科学院甘谷试验站提供。

1.2 方法

1.2.1 冬孢子悬浮液配制与孢子萌发统计 挑取少量燕麦散黑穗病菌冬孢子粉加入适量无菌蒸馏水，振荡摇匀、使孢子团充分散开即制得冬孢子悬浮液。冬孢子悬浮液浓度控制在低倍镜下可见病菌孢子数100。冬孢子萌发统计方法采用显微镜下检查，淡黄色为未成熟的冬孢子，不能萌发，不予统计。以芽管长度超过冬孢子直径1/2作为其萌发标准[7]。每时间段各处理检查至少200个以上冬孢子[9]。

1.2.2 疏亲水界面对冬孢子萌发的影响 用移液枪取冬孢子悬浮液，分别置于疏水(灭菌载玻片、燕麦叶片正面)、亲水(含有水琼脂培养基的表面、湿润的滤纸)界面上，标记接菌点，置于25 ℃培养箱中培养。分别于4，8，12，24 h后镜检冬孢子萌发情况，计算萌发率，每处理3次重复。

冬孢子萌发率(%)=[冬孢子萌发数/(冬孢子萌发数+未萌发孢子数)]×100%[10]。

1.2.3 温度对冬孢子萌发的影响 将配制的冬孢子悬浮液分别置于0、5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒温下保湿培养，分别于第4，8，12，24 h后在显微镜下观察记录冬孢子萌发情况，每处理重复3次。

1.2.4 湿度对冬孢子萌发的影响 用无菌水将冬孢子粉制成冬孢子悬浮液，置于载玻片上自然风干，置于相对湿度(RH)为40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%的恒温箱中25 ℃恒温培养，4，8 和12 h后镜检冬孢子萌发情况，每处理重复3次。

1.2.5 光照对冬孢子萌发的影响 将冬孢子粉制成的孢子悬浮液悬滴于水琼脂平板上，在25 ℃下以日光灯模拟自然光连续光照、连续黑暗、光暗交替各12 h，光照8 h黑暗16 h，光照16 h黑暗8 h，培养24 h后，镜检各处理孢子萌发情况，每处理重复3次。

1.2.6 pH对冬孢子萌发的影响 用磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制pH4、5、6、7、8、9的缓冲溶液，再以此溶液分别配制成对应pH的冬孢子悬液，将各处理冬孢子悬液悬滴于水琼脂培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中培养，分别于第4，8和12 h后镜检冬孢子萌发情况，每处理重复3次[11]。

1.2.7 碳、氮源对冬孢子萌发的影响 用6种碳源(1% 蔗糖、1% 葡萄糖、I% D-木糖、1% 甘露醇、l% 可溶性淀粉、1% 麦芽糖)和6种氮源(1% 乙酸铵、1% 氯化铵、1% 甘氨酸、1% 尿素、1% 蛋白胨、1% 硫酸铵)溶液制备冬孢子悬浮液，以无菌水为对照。将各处理冬孢子悬液悬滴于水琼脂培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中培养，12 h后镜检冬孢子萌发情况，每处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 冬孢子及冬孢子萌发形态

燕麦散黑穗病菌冬孢子团黑褐色，冬孢子(图1-A)球形或近球形，橄榄褐色。冬孢子萌发以直接产生芽管(图1-B)为主，常有分枝(图1-C)，在萌发时可以产生次生小孢子。

图1 燕麦散黑穗病菌冬孢子形态(A)及萌发形态(B、C)Fig.1 Morphology of teliospores (A) and germinating teliospores (B、C) of Ustilago avenae注:A.冬孢子(10×40);B.冬孢子4 h时萌发状态(10×40);C.冬孢子12 h时萌发状态(10×40)

2.2 疏亲水界面对燕麦散黑穗病菌冬孢子萌发的影响

散黑穗病菌冬孢子在燕麦叶片和滤纸上均不能萌发；水琼脂培养基上的萌发率最高，4 h时开始萌发，萌发率为19.84%；在12 h时萌发率达到76.57%(图2)，且芽管开始出现分枝。载玻片上冬孢子在12 h时的萌发率不超过5%，极显著低于水琼脂培养基的处理。结果表明，冬孢子在不同疏亲水界面上萌发率差异显著，且冬孢子萌发受亲水界面的诱导。

2.3 不同温度对燕麦散黑穗病菌冬孢子萌发的影响

燕麦散黑穗病菌冬孢子萌发温度范围10～35 ℃，但低温和高温影响冬孢子萌发率，5，40 ℃处理下的冬孢子始终不萌发(图3)。在10～25 ℃，冬孢子萌发率随温度升高而增加，25 ℃处理的冬孢子萌发率最高；低于10 ℃与高于35 ℃的各处理间冬孢子萌发率没有显著差异(P>0.05)。在4个试验时间段内，4 h时冬孢子萌发率在0.94%～15.28%；8 h时，35 ℃处理的散黑穗病菌冬孢子开始萌发，萌发率为1.07%，25 ℃处理萌发率最高，为56.13%；12 h时，10 ℃处理下的孢子开始萌发，20与25 ℃处理的芽管粗壮且开始出现分枝，30 ℃处理的冬孢子萌发率较低，芽管细长；24 h时，5 ℃处理的散黑穗病菌冬孢子开始萌发，而25 ℃处理下其冬孢子萌发率达到91.51%。结果表明，温度越低，散黑穗病菌冬孢子萌发所需时间越长。

图2 疏亲水界面下冬孢子萌发Fig.2 Effect of lyophobic and hydrophilic interface on teliospore germination

注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

图3 不同培养温度下冬孢子萌发Fig.3 Effect of temperature on teliospore germination

2.4 不同湿度对燕麦散黑穗病菌冬孢子萌发的影响

冬孢子在相对湿度(RH)≤80%时始终不萌发；RH为90%的冬孢子12 h时有萌发，且萌发率均小于5%；RH为95%处理的散黑穗病菌冬孢子8 h时开始萌发，并在12 h时萌发率达到6.91%；RH为100%处理的冬孢子4 h时开始萌发，8h时萌发率超过5%，12 h时萌发率为7.84%；但整体来说所有处理萌发率均小于10%，与水琼脂培养基上冬孢子萌发率差异显著(表1)；所有萌发的冬孢子芽管均无分枝。

表1 不同湿度处理下冬孢子萌发Table 1 Effect of humidity on teliospore germination

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

2.5 不同光照时间对散黑穗病菌冬孢子萌发的影响

光照8 h处理的冬孢子萌发率高于其他处理，并与其他处理存在显著差异(图4)；光照24 h的冬孢子萌发率仅次于光照8 h的处理，但光照24、16、12、0 h处理间的散黑穗病菌冬孢子萌发率均未达到显著差异(P>0.05)，即表明光照时间对冬孢子萌发的影响不大。

图4 不同光照处理下冬孢子萌发Fig.4 Effect of light illumination time on teliospore germination

2.6 pH对散黑穗病菌冬孢子萌发的影响

燕麦散黑穗病菌冬孢子对pH值的要求较低，在较大的pH范围内都能萌发，酸碱都能影响冬孢子萌发率，但酸性条件影响作用更显著(图5)。其中，pH为4时冬孢子萌发率最高，随着pH的升高，冬孢子悬浮液碱性增强，冬孢子萌发率呈现下降趋势，pH为9时冬孢子萌发率最低；pH为8和9时冬孢子萌发率显著低于pH为4、5、6、7的处理(P<0.05)。由此可见，酸性条件有利于冬孢子萌发，而碱性条件对冬孢子萌发有抑制作用。

图5 不同pH下冬孢子萌发Fig.5 Effect of pH on teliospore germination

2.7 不同碳、氮源对燕麦散黑穗病菌冬孢子萌发的影响

在葡萄糖溶液中，散黑穗病菌冬孢子萌发率高达79.38%，与可溶性淀粉及对照之间无显著差异(表2)；D-木糖、麦芽糖、甘露醇溶液中的冬孢子萌发率显著低于对照，说明此3种溶液对冬孢子萌发有抑制作用。在尿素和蛋白胨溶液中的冬孢子萌发率显著高于对照，而甘氨酸溶液中的冬孢子萌发率显著低于对照，说明不同氮源对冬孢子萌发影响各异。

表2 不同碳、氮源下冬孢子萌发Tab.2 Effect of different carbon and nitrogen sources on teliospore germination

3 讨论和结论

不同病菌最适培养条件不尽相同[8]。研究结果表明，燕麦散黑穗病菌冬孢子的萌发与外界环境条件密切相关，温度、湿度和pH对冬孢子萌发均有直接影响。冬孢子在亲水和软水琼脂培养基上具有较高的萌发率，在较亲水和硬的载玻片上萌发率较低，冬孢子萌发受亲水性和软的表面的诱导，而徐婵等[10]对美味黑粉菌(Ustilagoesculenta)冬孢子萌发条件研究结果是美味黑粉菌冬孢子萌发受疏水界面的诱导，出现这种差异的原因可能是试验材料致病菌不同。

燕麦散黑穗病菌冬孢子适宜萌发温度20～25 ℃，温度偏高或偏低都不利于孢子萌发，与前人研究的稻粒黑粉病菌(Neovossiahorrida)[9-11]、白头翁黑粉病菌(Urocystispulsatillae)[12]冬孢子萌发条件中温度试验结果相似。冬孢子萌发对湿度的要求较高，只有在RH>90%时冬孢子才可以萌发，且萌发率不高，与樊永军等[13]、刘正坪等[14]的研究结果一致；光照对冬孢子萌发的影响不大，只有光照8 h处理的冬孢子萌发率与其他处理存在显著差异，其他各处理之间均无显著差异；适宜冬孢子萌发的pH为4～7，碱性条件可以抑制孢子的萌发，这一结果与前人在白头翁黑粉病(载玻片)[12]、小麦散黑粉病(水琼脂培养基)[14]和甘蔗黑穗病(载玻片)[16]上报道的结果基本一致，而陈胜军等[11]认为，稻粒黑粉病冬孢子在PSA培养基上pH为7时萌发率最高，此种差异可能是由于孢子萌发所用培养基和致病菌不同造成的。

最适碳源为葡萄糖，此结果与前人报道的结果不同，有学者认为葡萄糖可以促进芦苇黑粉病冬孢子萌发[15]，吴伟怀等[16]认为蔗糖对甘蔗黑穗病冬孢子萌发的促进作用大于葡萄糖，而本试验中的蔗糖对燕麦散黑穗病菌冬孢子萌发有抑制作用，此种差异可能与菌种有关；同时，适宜燕麦散黑穗病冬孢子萌发的氮源为蛋白胨和尿素，说明有机N素比无机N素更有利于冬孢子的萌发[13]。也有试验证明氮素过多能使稻粒黑粉病加重[17]。

该试验的散黑穗病菌冬孢子来源单一，休眠时间较短，越冬处理方式单一，是否不同地域的冬孢子萌发条件一致、休眠时间是否影响孢子萌发、燕麦病粒处理不当是否可以促进冬孢子萌发等问题还有待进一步的研究。所有冬孢子萌发试验都是在氧气充足的条件下进行，是否厌氧条件可以抑制冬孢子萌发也有待进一步的研究。施用PGPR菌肥可促进燕麦根长、根系干重及根体积等根系性状的改善[18]，是否可通过施用菌肥增强燕麦抗病能力也同样值得一试。

燕麦散黑穗病菌冬孢子萌发受亲水界面的诱导，在水琼脂培养基上萌发率可达76.57%；适宜萌发的温度20～25℃；对湿度要求很高，RH≥90%时开始萌发，萌发率<10%；光照对孢子萌发的影响不明显；最适pH为4～7，最适碳源和氮源分别为葡萄糖和蛋白胨。

参考文献:

[1] 曲祥春,何中国,郝文媛,等.我国燕麦生产现状及发展对策[J].杂粮作物,2006,26(3):233-235.

[2] 张新军,周海涛,李天亮,等.燕麦野生资源的收集评价与利用[J].河北农业科学,2011,15(1):6-7,10.

[3] Menzies J G,Bakkeren G,Matheson F.Use of inter-simple sequence repeats and amplified fragment length polymorphisms to analyze genetic relationships among small grain-infecting species of Ustilago.Phytopathology,2003,93(2):167.

[4] 孟有儒.甘肃省经济作物植物病害志[M].兰州:甘肃科学技术出版社,2003,168-169.

[5] 杨海鹏,孙泽民.中国燕麦[M].北京:农业出版社,1989.230-240.

[6] 刘欢,赵桂琴.燕麦抗逆性研究进展[J].草原与草坪,2007,125(6):63-67.

[7] 梁继农,袁树忠,印毅,等.制约稻粒黑粉病菌冬孢子萌发的关键因素[J].植物保护学报,2003,30(4):343-346.

[8] 汤春梅,陈秀蓉,姚拓,等.九种根际促生菌最适培养条件初探[J].草原与草坪,2005,110(3):27-30.

[9] 刘占山,任新国,李霞生,等.稻粒黑粉病菌孢子萌发的影响因素试验[J].河南科技大学学报(自然科学版),2006,27(3):65-67.

[10] 徐婵,张敬泽,王晓清,等.美味黑粉菌冬孢子萌发条件的研究[J].长江蔬菜,2012(16):104-107.

[11] 陈胜军,王艳丽,张震,等.稻粒黑粉菌冬孢子萌发影响因素及其产孢培养基的筛选[J].浙江农业学报,2011,23(3):572-576．

[12] 傅俊范,苏丹,周如军,等.白头翁黑粉病菌生物学特性研究[J].沈阳农业大学学报,2010,41(2):203-205.

[13] 李广领,陈锡岭,秦雪峰,等.玉米瘤黑粉菌冬孢子生物学特性及三种杀菌剂对其萌发的影响[J].湖南农业科学,2007(4):125-127,128.

[14] 樊永军,李发虎.小麦散黑粉病菌(Ustilagotritici)冬孢子生物学特性研究[J].阴山学刊,2006,20(4):34-35.

[15] 谭语词,裴艳.芦苇三种黑粉病菌冬孢子萌发试验初报[J].植保土肥,2007,19.

[16] 吴伟怀,谢祖健,贺春萍,等.甘蔗黑穗病菌冬孢子生物学特性及杀菌剂对其萌发的影响[J].热带作物学报,2009,30(11):1674-1678.

[17] 胡淼,李树强,陈祝平.施氮肥过多导致稻粒黑粉病加重[J].植物保护,1987,13(6):50.

[18] 韩文星,姚拓,梁启鹏,等.PGPR菌肥对燕麦根系性状影响的研究[J].草原与草坪,2008,129(4):1-4.