一氧化氮对铅胁迫下杂花苜蓿种子萌发及幼苗生理特性的影响

向 华，南丽丽，李春晓，王克婧，杜 玺

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

铅是重金属“五毒”之一，它不仅阻碍植物生长发育，降低作物产量和质量，还可通过食物链的富集，被吸收到人体并严重危害人体健康[1]。NO是生物体中氧化还原信号分子和毒性分子，也是一种活性氮(RNS)。在植物体内通过一氧化氮合酶(NOS)和硝酸还原酶(NR)催化形成[2]。研究表明，铅对植物种子萌发及幼苗生长的影响通过其改变植物生理生化过程实现。魏学玲等[3]利用室内水培试验研究发现，外源NO促进Pb2+胁迫下小麦种子萌发及幼苗生长，增强小麦对Pb2+胁迫的适应性，并能有效地缓解Pb2+胁迫下叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量的降低。张远兵等[4]发现，外源NO对Pb2+1 000 mg/L胁迫下高羊茅生长影响具有剂量效应，适宜浓度能缓解铅毒害，提高耐铅性。孙立荣等[5]研究发现，50～100 μmol/L的外源NO供体硝普钠(SNP)可以促进盐胁迫下黑麦草幼苗的生长，且100 μmol/L SNP促进效果最明显。雍山玉等[6]发现NO对植物体的作用具有双重性，低浓度(100和300 μmol/L)SNP浸种处理能显著缓解NaCl胁迫，抑制辣椒种子的萌发。

苜蓿为优质豆科牧草，具有产量高、持久性好、饲用价值高、用途广等众多优点，在世界各地的畜牧业中发挥着重要的作用。苜蓿除了用于饲养牲畜之外，还可以作为护坡植物，园林上多用作盐碱地、贫瘠土地的绿化草种和景观野花用草种，同时也是很有利用价值的土壤铅污染修复植物。为此，研究外源NO供体SNP结合Pb2+处理对杂花苜蓿种子萌发及幼苗生理生化特性的影响，以期通过调节NO水平来改善植物生理状况，为深入研究农作物Pb2+毒害的缓解技术提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验设计

1.1.1 供试苜蓿品种为杂花苜蓿阿尔冈金，种子由甘肃农业大学草业学院提供。发芽试验于2012年5～6月在培养室进行。杂花苜蓿种子用蒸馏水反复冲洗然后吸干，于25 ℃下，设置6个处理，分别为CK完全Hoagland营养液；T1 Hoagland营养液+100 μmol/L SNP；T2 Hoagland营养液+250 mg/L氯化铅；T3 Hoagland营养液+500 mg/L氯化铅；T4 Hoagland营养液+100 μmol/L SNP+250 mg/L氯化铅；T5 Hoagland营养液+100 μmol/L SNP+500 mg/L 氯化铅，先浸种24 h，再于28 ℃催芽24 h后，选发芽一致的种子，播于放有湿润滤纸10 cm的培养皿中，每蒸发皿100粒，置25 ℃，光照强度3 000 lx，每天光照12 h的培养室中培养，定时取样分析测定，每组重复7次。

1.1.2 幼苗培养 试验选用清洗干净的细沙，用去离子水反复冲洗后烘干备用。选发芽一致的种子，播于装有280 g干燥细沙的塑料杯内。待幼苗长出真叶时，选长势良好且一致的幼苗转移到含Hoagland营养液的培养钵中继续培养至三叶期时，设置6个处理，完全随机设计，重复4次。各处理继续培养20 d后，冲洗干净叶片，用滤纸吸干多余水分，封入密封袋并迅速放入液氮中速冻，贮存于-80 ℃超低温冰箱，用于各生理指标的测定。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 发芽势、发芽率、胚芽、胚根的测定 发芽期间每隔24 h记录1次，第4 d统计发芽势、第10 d统计发芽率，胚根长和胚芽长采用精度0.1 mm游标卡尺测量，每处理随机抽取20株幼苗，分别测定，求平均数。

1.2.2 生理指标的测定 植株根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定，游离脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定，可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑光化还原法测定，过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定[7]。

1.3 数据处理

用Excel 2003处理数据和绘图，SPSS 16.0统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 SNP对Pb胁迫下杂花苜蓿种子萌发的影响

种子萌发是作物对外界有所反应的开始，也是作物对外界反应的敏感期。T1处理100 μmol/L SNP、T2处理250 mg/L氯化铅(低Pb2+浓度)、T4处理100 μmol/L SNP+250 mg/L 氯化铅(SNP与低Pb2+浓度组合)均提高了苜蓿种子的发芽势、发芽率和胚根胚芽长(表1)，与对照相比，发芽势、发芽率、胚根长、胚芽长依次提高6.49%，10.17%和22.03%，3.11%，10.17%和2.28%，4.93%，2.35%和22.77%，4.84%，17.44%和20.90%；T3处理500 mg/L氯化铅(高Pb2+浓度)明显降低了苜蓿种子的发芽势、发芽率、胚根长(P<0.05)，与CK相比，分别降低了9.04%，6.57%和11.74%；T5处理100 μmol/L SNP+500 mg/L氯化铅(SNP与高 Pb2+浓度组合)处理明显缓解了高铅胁迫对种子发芽势、胚根长的抑制作用，分别较T3处理增加了9.32%和11.17%(P<0.05)。

表1 SNP对Pb胁迫下杂花苜蓿种子萌发的影响Table 1 Effects of nitric oxide on seed germination under Pb stress

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

2.2 SNP对Pb胁迫下杂花苜蓿脯氨酸和可溶性蛋白含量的影响

各处理脯氨酸含量均显著高于对照(P<0.05)(图1)，分别较对照增加了49.19%、55.37%、128.62%、207.66%和57.28%。T4和T3处理可溶性蛋白质含量显著高于对照(P<0.05)，分别较对照增加3.84%和2.14%，其他处理与对照差异均不显著。

2.3 SNP对Pb胁迫下杂花苜蓿可溶性糖和根系活力的影响

由图2可知，T1，T4和T5处理的可溶性糖含量增幅显著(P<0.05)；T2和T3处理可溶性糖含量降幅显著(P<0.05)，分别下降了26.81%和21.06%。T1和T2处理的根系活力均显著高于对照(P<0.05)，分别较对照增加13.28%和21.30%，其他处理均显著低于对照(P<0.05)。

2.4 SNP对Pb胁迫下苜蓿MDA含量的影响

由图3可知，T3，T4和T5处理的MDA含量均显著大于对照(P<0.05)，分别是对照的2.26,1.55和2.13倍；T2显著小于对照(P<0.05)，比对照小23.33%；T1处理与对照差异不明显。

图1 SNP对Pb胁迫下杂花苜蓿脯氨酸和可溶性蛋白含量的影响Fig.1 Effects of NO on proline and protein contents under Pb stress

图2 SNP对Pb胁迫下苜蓿可溶性糖和根系活力的影响Fig.2 Effects of NO on water soluble sugar content and root activity under Pb stress

图3 SNP对Pb胁迫下杂花苜蓿MDA含量的影响Fig.3 Effects of NO on MDA content under Pb stress

3 讨论与结论

Pb2+是一种对植物生长发育有毒害的重金属元素。种子能否正常萌发是某物种在某一地区形成自然群落的关键因素[8]。研究种子萌发对逆境胁迫的反应，是系统认识逆境伤害机理的较好途径。NO作为一种信号分子能促进种子萌发、提高种子的发芽率、促进胚芽和胚根生长[9]。在试验中，T1(SNP)、T2(低Pb2+浓度)和T4(SNP与低Pb2+浓度组合)处理下，苜蓿种子的发芽势、发芽率、胚芽胚根长均高于相应对照，说明NO、低铅浓度、NO与低铅浓度组合胁迫均对苜蓿种子的萌发有促进作用。

研究表明，Pb2+进入植物体内后绝大部分累积在根部[10]，其原因是Pb2+在根系主要以Pb(PO4)2和PbCO3等沉淀形式存在，在植物汁液中也有离子态和络合态Pb，由于吸持、钝化或沉淀作用，植物根系所吸收的Pb向地上部运输较困难，根系活力是反映其生长状况的重要指标。脯氨酸作为重要的渗透调节物与植物体内活性氧自由基的清除以及膜脂过氧化作用的减弱有密切的关系[11]。植物在逆境条件下通过积累可溶性糖等有机物来调节细胞渗透压，以增加适应环境的能力[12]。可溶性蛋白含量升高有助于提高植物对逆境的抵抗力[13，14]。MDA是膜脂过氧化的产物，其含量的变化可作为检测逆境条件下膜系统受伤害程度的指标[15，16]。试验表明，与对照比较，T2处理下的杂花苜蓿幼苗，其MDA含量显著下降，表明杂花苜蓿幼苗对铅具有一定的耐性，低浓度促进其生长，这与王艳等[17]在剪股颖、白彦真等[18]在紫花苜蓿上的研究结果一致；用T1处理杂花苜蓿幼苗，其MDA含量与对照差异不显著，但小于对照，表明外源NO供体SNP可促进杂花苜蓿幼苗的生长，这与前人在水稻[19]、向日葵[20]、白羽扇豆幼苗[21]、辣椒[6]和黑麦草[22]的研究结果相似，说明NO是一种植物生长调节剂，能够像生长素一样调控植物生长；用T3(高Pb2+浓度)和T5(SNP与高Pb2+浓度组合)处理杂花苜缩幼苗，其MDA含量显著增加，表明高浓度铅胁迫下苜蓿幼苗膜脂过氧化水平提高，膜系统的稳定性下降；用T4处理杂花苜蓿幼苗，MDA含量虽高于对照，但显著小于T3和T5处理，表明植株体内的可溶性糖、可溶性蛋白质、脯氨酸等渗透调节物质已经启动，提高了植株清除自由基防御系统的防御能力，缓解了高铅胁迫对苜蓿幼苗的氧化损伤作用，使细胞膜受活性氧的伤害减轻。

综上所述，低Pb2+浓度(250 mg/L )、SNP(100 μmol/L)、SNP与低Pb2+浓度(100 μmol/L SNP+250 mg/L)组合处理均增加了杂花苜蓿种子发芽势、发芽率、胚芽胚根长，提高了幼苗脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白质的含量，增强了根系活力，降低了MDA含量；高Pb2+浓度(500 mg/L)抑制了杂花苜蓿种子萌发和幼苗的生长，且100 μmol/L SNP不能缓解高铅胁迫对植株的影响。

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