乳腺癌中FoxP3表达与上皮间质转化的相关性及其意义*

霍莉莉 李 慧 魏 枫 赵 华 任秀宝

乳腺癌中FoxP3表达与上皮间质转化的相关性及其意义*

霍莉莉 李 慧 魏 枫 赵 华 任秀宝

目的：探讨乳腺癌组织FoxP3、TGF-β1的表达和上皮间质转化（EMT）的相互关系及其临床意义。方法：免疫组织化学法检测74例乳腺癌组织中FoxP3、TGF-β1、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Fibronectin的表达情况，分析乳腺癌FoxP3蛋白表达与临床病理特征的关系，以及FoxP3、TGF-β1的表达和EMT发生之间的关系。结果：FoxP3与TGF-β1的表达率和EMT的发生率分别为36.5%（27/74）、39.2%（29/74）和40.5%（30/74）。乳腺癌FoxP3表达与淋巴结转移相关（P＜0.05），与其他临床病理特征无关（P＞0.05）。FoxP3和TGF-β1的表达之间存在相关性，而TGF-β1可以促进EMT发生（P＜0.05）。结论：FoxP3的表达与乳腺癌淋巴结转移和EMT的发生相关，可能作为预测乳腺癌转移可能性的标记物。

乳腺癌 FoxP3 TGF-β1 上皮间质转化

FoxP3是叉头样转录因子家族的成员之一，早期发现其特异性表达于CD4+CD25+调节性T细胞，参与细胞发育和免疫抑制功能的发挥［1］。近年来发现，乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞也有FoxP3的表达［2-4］。有研究认为肿瘤细胞表达FoxP3能够促进肿瘤发生淋巴结转移和远处转移，是肿瘤预后不良的独立预测因素之一［5-8］。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是具有极性的上皮细胞转化成为具有移行能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程，其在人胚胎干细胞分化过程中起着关键作用，在组织修复再生、器官纤维化和肿瘤发生时被重新激活［9］。目前普遍认为EMT是肿瘤细胞发生侵袭与转移的重要机制［10-12］。

本研究采用免疫组织化学方法检测FoxP3蛋白和EMT标志物在人乳腺癌组织中的表达水平，探讨FoxP3和EMT之间是否存在相互联系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 患者资料 所有标本均取自天津医科大学肿瘤医院乳腺外科2003年5月至2005年7月手术切除的浸润性乳腺癌组织标本，共74例，经病理确诊均为非特殊型浸润性导管癌。患者均为女性，年龄分布27～69岁（中位年龄49岁）。手术前均未接受过抗癌治疗（包括放疗、化疗及内分泌治疗等）。术后分期：Ⅰ期3例，ⅡA期26例，ⅡB期24例，ⅢA期8例，ⅢB期2例，ⅢC期10例，Ⅳ期1例。组织学分级：Ⅰ级4例，Ⅱ级49例，Ⅲ级21例。ER（+）14例，PR（+）12例，Her-2（+）45例。

1.1.2 主要试剂 鼠抗人FoxP3单克隆抗体（PCH101）购自美国eBioscience公司。兔抗人TGF-β1多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Fibronectin鼠抗人单克隆抗体购自美国BD公司。EnVision两步法免疫组织化学检测试剂购自福州迈新生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测乳腺癌组织中FoxP3、TGF-β1和EMT标志物的表达 标本经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，常规HE染色及En-Vision法免疫组织化学染色。石蜡切片常规脱蜡水化，柠檬酸钠缓冲液热抗原修复，3%H2O2室温孵育20 min阻断内源性过氧化物酶活性。滴加一抗，4℃孵育过夜。滴加酶标记的二抗，湿盒室温孵育30 min。DAB显色，苏木精对比染色。常规酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。以PBS代替一抗做阴性对照。

1.2.2 阳性结果判断 1）FoxP3以乳腺癌细胞细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达，阳性细胞数≥25%为FoxP3表达阳性切片。2）TGF-β1以细胞质内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性着色。结果采用半定量计分方法，阳性细胞数按无着色、阳性细胞数≤20%、21%～50%和＞50%分别判为0、1、2、3分，着色强度按无着色、黄色、棕黄色和棕褐色分别判为0、1、2、3分。两项评分结果相乘＞6视为强阳性表达。3）EMT标志物：①E-Cadherin以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数＞50%为阳性切片。②N-Cadherin以细胞膜和（或）细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数＞1%为阳性切片。③Vimentin以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数＞1%为阳性切片。④Fibronectin以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数＞1%为阳性切片。其中E-Cadherin为上皮细胞标志物，N-Cadherin、Vimentin和Fibronectin为间质细胞标志物。上皮细胞标志物表达阴性或者任一间质细胞标志物表达阳性计为EMT阳性（+）。

1.3 统计学方法

数据采用PASW Statistics 18.0统计软件进行Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验和χ2检验，用偏相关分析和二元Logistic回归分析进行相关性分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FoxP3和TGF-β1的表达情况

FoxP3在乳腺癌细胞最常见的表达部位为细胞质，其次为细胞质与细胞核均表达，最少见的表达模式是仅细胞核表达。考虑到FoxP3是转录因子，只有进入细胞核内才能发挥作用，所以将胞核阳性作为FoxP3表达阳性的评价标准。在所有检测的乳腺癌组织中，36.5%（27/74）的病例FoxP3蛋白表达阳性。39.2%（29/74）的病例高表达TGF-β1（图1）。

2.2 乳腺癌组织FoxP3的表达与患者临床病理特征的关系

比较乳腺癌实质FoxP3蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、pTNM分期、ER、PR、Her-2的关系，发现FoxP3的表达与淋巴结转移有关（P＜0.05），与其他指标无关（P＞0.05，表1）。

2.3 EMT标志物的表达情况

E-Cadherin主要表达于细胞膜，部分亦表达于细胞质。其阳性表达率为71.6%。N-Cadherin表达于细胞膜和（或）细胞质，其阳性表达率为37.8%。Vimentin表达于细胞质，其阳性表达率为20.3%。Fibronectin表达于细胞膜，其阳性表达率为12.2%。根据EMT发生的判定标准，EMT阳性率为40.5%（图1）。

2.4 乳腺癌中FoxP3、TGF-β1和EMT发生的相关情况

1）应用二元Logistic回归分析向后步进法分析FoxP3和TGF-β1与EMT的关系。以EMT为因变量Y（未发生=0，发生=1），以FoxP3和TGF-β1为自变量X，建立 Logistic回归模型：Logit（p）=-0.901+1.249×TGF-β1。Logistic回归模型似然比检验结果差异有统计学意义（χ2=6.481，df=1，P=0.011），回归系数Wald χ2检验显示P=0.013。优势比OR=3.487（1.308，9.297），95%CI上下限均＞1，因此可以认为TGF-β1的表达可以诱导EMT发生。2）在控制EMT的条件下进行FoxP3与TGF-β1的偏相关分析，发现两者之间存在相关性（P＜0.001）。可据此认为在消除EMT影响的条件下，乳腺癌FoxP3与TGF-β1的表达间存在相关性。

图1 免疫组织化学检测FoxP3、TGF-β1和EMT标志物的表达 （SP×400）Figure 1 Immunohistochemical staining detected the expression of FoxP3,TGF-β1 and markers of EMT （SP×400）

表1 乳腺癌组织FoxP3的表达与患者临床病理特征的关系Table 1 Correlation between expression of FoxP3 and clinicopathologic features of breast carcinoma

3 讨论

FoxP3是影响CD4+CD25+调节性T细胞发育的一个关键转录因子，并且能维持其免疫抑制功能，一直被认为是CD4+CD25+调节性T细胞的特异性标志［13］。之后研究发现FoxP3在部分CD4+CD25-T细胞和CD8+T细胞也有表达［14］，而近年来研究证实FoxP3在多种人正常上皮细胞和肿瘤细胞亦有表达，影响肿瘤的发生发展以及肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用。胰腺癌和黑色素瘤细胞异常表达FoxP3，在共培养条件下能够抑制初始CD4+CD25-T细胞的增殖，促进肿瘤细胞免疫逃逸［2，15］。

本研究结果显示，在74例检测的乳腺癌组织中，36.5%的病例FoxP3蛋白表达阳性，并且乳腺癌组织表达FoxP3与淋巴结转移相关（P＜0.05），提示FoxP3可能在肿瘤的进展和转移过程中发挥作用。Merlo等［8］发现乳腺癌表达FoxP3能够作为发生远处转移风险的预测因素。同时，本研究也发现FoxP3的表达与转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表达以及EMT相关，提示其可能通过调节TGF-β1而影响EMT，从而影响肿瘤的进展。

上皮细胞在EMT过程中发生一系列生物学改变，如细胞极性消失、丧失细胞间连接、细胞游走或散在分布以及重新表达间质细胞标志物等，从而转化为具有间质特点的间质样细胞［9］。EMT不仅存在于胚胎发育和组织分化过程中，同时也参与组织修复、器官纤维化以及肿瘤的浸润转移［9］。EMT能够赋予细胞侵袭和转移能力、诱导干细胞特性、阻止自身凋亡和衰老以及诱发免疫抑制等［9］，这些特性对于肿瘤的侵袭与转移至关重要，因此近年来EMT的诱发因素及其与肿瘤微环境之间的相互作用一直是研究热点。转化生长因子-β、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、基质金属蛋白酶等都可以诱导肿瘤细胞发生EMT，而其中研究时间最久、机制阐释最为透彻的就是TGF-β1［16-19］。在体外培养条件下外源添加TGF-β1能够诱导乳腺癌细胞系发生EMT［20］，而近年来研究认为细胞自分泌TGF-β1在诱导细胞发生EMT中发挥作用，同时也参与细胞经历EMT后的间质细胞样状态的维持［21-22］。Zuo等［3］报道乳腺癌细胞表达FoxP3。有文献报道用siRNA抑制黑色素瘤细胞表达FoxP3能够下调TGF-β1的表达；反之，过表达FoxP3能够上调TGF-β1的表达［15］。即肿瘤细胞可以通过FoxP3上调TGF-β1的表达，从而影响EMT作用进而促进肿瘤的进展和转移。

本实验发现乳腺癌细胞FoxP3的表达和TGF-β1的高表达之间存在相关性，而且TGF-β1与EMT发生相关（P＜0.05）。推测乳腺癌细胞可能通过FoxP3调节TGF-β1表达，而TGF-β1通过自分泌的形式参与乳腺癌细胞EMT的发生与维持过程。近期研究表明，FoxP3可以控制多种与TGF-β信号通路和EMT相关的基因表达，进一步支持了本文的结论［23］。

虽然随着治疗方法的不断改进，乳腺癌的生存率得到了极大地提高，但是肿瘤转移仍然是威胁患者生存的重要原因。本结果显示FoxP3在乳腺癌转移中扮演重要角色，有可能是新的分子标志物，成为免疫治疗的新靶点。

1 Hori S.Control of Regulatory T Cell Development by the Transcription Factor Foxp3[J].Science,2003,299(5609)：1057-1061.

2 Hinz S,Pagerols-Raluy L,Oberg HH,et al.Foxp3 Expression in Pancreatic Carcinoma Cells as a Novel Mechanism of Immune Evasion in Cancer[J].Can Res,2007,67(17)：8344-8350.

3 Zuo T,Wang L,Morrison C,et al.FOXP3 Is an X-Linked Breast Cancer Suppressor Gene and an Important Repressor of the HER-2/ErbB2 Oncogene[J].Cell,2007,129(7)：1275-1286.

4 Ebert LM,Tan BS,Browning J,et al.The Regulatory T Cell-Associated Transcription Factor FoxP3 Is Expressed by Tumor Cells[J].Can Res,2008,68(8)：3001-3009.

5 Winerdal ME,Marits P,Winerdal M,et al.FOXP3 and survival in urinary bladder cancer[J].Bju International,2011,108(10)：1672-1678.

6 Dimitrakopoulos FID,Papadaki H,Antonacopoulou AG,et al.Association of FOXP3 Expression with Non-small Cell Lung Cancer[J].Anticancer Research,2011,31(5)：1677-1683.

7 Wang LH,Su L,Wang JT.Correlation between elevated FOXP3 expression and increased lymph node metastasis of gastric cancer[J].Chin Med J,2010,123(24)：3545-3549.

8 Merlo A,Casalini P,Carcangiu ML,et al.FOXP3 Expression and Overall Survival in Breast Cancer[J].J Clin Oncol,2009,27(11)：1746-1752.

9 Thiery JP,Acloque H,Huang RYJ,et al.Epithelial-Mesenchymal Transitions in Development and Disease[J].Cell,2009,139(5)：871-890.

10 Trimboli AJ,Fukino K,de Bruin A,et al.Direct Evidence for Epithelial-Mesenchymal Transitions in Breast Cancer[J].Can Res,2008,68(3)：937-945.

11 Jeong H,Ryu YJ,An J,et al.Epithelial-mesenchymal transition in breast cancer correlates with high histological grade and triple-negative phenotype[J].Histopathology,2012,60(6B)：E87-95.

12 Hanahan D,Weinberg Robert A.Hallmarks of Cancer：The Next Generation[J].Cell,2011,144(5)：646-674.

13 Fontenot JD,Gavin MA,Rudensky AY.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Natu Immu,2003,4(4)：330-336.

14 Roncador G,Brown PJ,Maestre L,et al.Analysis of FOXP3 protein expression in human CD4(+)CD25(+)regulatory T cells at the single-cell level[J].Euro J Immu,2005,35(6)：1681-1691.

15 Niu J,Jiang C,Li C,et al.Foxp3 expression in melanoma cells as a possible mechanism of resistance to immune destruction[J].Can Immu,2011,60(8)：1109-1118.

16 Billottet C,Tuefferd M,Gentien D,et al.Modulation of several waves of gene expression during FGF-1 induced epithelial-mesenchymal transition of carcinoma cells[J].J Cel Bio,2008,104(3)：826-839.

17 Cheng JC,Auersperg N,Leung PC.EGF-induced EMT and invasiveness in serous borderline ovarian tumor cells：a possible step in the transition to low-grade serous carcinoma cells[J]?PLoS One,2012,7(3)：e34071.

18 Radisky DC,Levy DD,Littlepage LE,et al.Rac1b and reactive oxygen species mediate MMP-3-induced EMT and genomic instability[J].Nature,2005,436(7047)：123-127.

19 Katsuno Y,Lamouille S,Derynck R.TGF-β signaling and epithelial-mesenchymal transition in cancer progression[J].Cur Opin in Oncol,2013,25(1)：76-84.

20 Walsh LA,Damjanovski S.IGF-1 increases invasive potential of MCF 7 breast cancer cells and induces activation of latent TGF-β1 resulting in epithelial to mesenchymal transition[J].Cell Commun Signal,2011,9(1)：10.

21 Gregory PA,Bracken CP,Smith E,et al.An autocrine TGF-β/ZEB/miR-200 signaling network regulates establishment and maintenance of epithelial-mesenchymal transition[J].Mol Biol the Cell,2011,22(10)：1686-1698.

22 Xu QL,Wang L,Li HL,et al.Mesenchymal stem cells play a potential role in regulating the establishment and maintenance of epithelial-mesenchymal transition in MCF7 human breast cancer cells by paracrine and induced autocrine TGF-beta[J].Int J Oncol,2012,41(3)：959-968.

23 Triulzi T,Tagliabue E,Balsari A,et al.FOXP3 expression in tumor cells and implications for cancer progression[J].J Ce Phy,2013,228(1)：30-35.

（2013-07-13收稿）

（2013-08-24修回）

Clinical significance of FoxP3 and the correlation of FoxP3 expression with epithelial-mesenchymal transition in breast cancer

Lili HUO1,2,3,Hui LI1,2,3,Feng WEI1,2,3,Hua ZHAO1,2,3,Xiubao REN1,2,3

Xiubao REN;E-mail:rwziyi@yahoo.com
1Department of Immunology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,2National Clinical Research Center of Cancer,and3Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy,Tianjin,Tianjin 300060,China.

Objective:This study aims to investigate the correlation between the expression of FoxP3,TGF-β1,and epithelial-mesenchymal transition(EMT)in breast cancer and to determine the clinical significance of FoxP3.Methods:The expression of FoxP3,TGF-β1,E-Cadherin,N-Cadherin,Vimentin,and Fibronectin protein were detected in the cancer cells of 74 cases with breast carcinoma via immunohistochemistry.The correlation of FoxP3 protein with clinico-pathologic features of breast carcinoma and the relationships among the expressions of FoxP3,TGF-β1,and epithelial-mesenchymal transition(EMT)were analyzed.Results:The expression rates of FoxP3,TGF-β1,and EMT are 36.5%(27/74),39.2%(29/74),and 40.5%(30/74),respectively.The FoxP3 protein expression in breast cancer is correlated with lymph node metastasis(P＜0.05)but not with other clinico-pathological features(P＞0.05).The expression of FoxP3 is also correlated with the expression of TGF-β1.Furthermore,TGF-β1 can induce EMT(P＜0.05).Conclusion:The expression of FoxP3 is correlated with lymph node metastasis and EMT in breast cancer.Therefore,FoxP3 may be a marker for predicting metastasis.

breast cancer,FoxP3,TGF-β1,epithelial-mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1000-8179.20131533

天津医科大学肿瘤医院免疫室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤免疫与生物治疗重点实验室（天津市300060）

*本文课题受国家自然科学基金（编号：81171983）、天津市应用基础及前沿技术研究计划（编号：12JCYBJC16100）和国家重点基础研究发展计划“973”项目（编号：2012CB9333004）资助

任秀宝 rwziyi@yahoo.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81171983),Tianjin Research Projects for Application Foundation and cutting-edge Technologies(No.12JCYBJC16100)and the National"973"Program of China(No.2012CB9333004).

（本文编辑：贾树明）

霍莉莉 硕士生在读，主要研究方向为肿瘤免疫在肿瘤转移中的作用机制。

E-mail：shanping.li@aliyun.com