补充n-3多不饱和脂肪酸对高脂饮食大鼠肠道菌群及门静脉血内毒素的影响

2014-09-09 09:30曹战江于健春康维明马志强田树波
中国医学科学院学报 2014年5期
关键词:内毒素菌门高脂

曹战江,于健春,康维明,马志强,叶 欣,田树波

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院基本外科,北京100730

肥胖症目前已成为世界范围内重要的公共健康问题,在中国,超重和肥胖人口分别超过22.8%和7.1%[1]。肥胖主要为脂肪在体内异常蓄积,可引起糖尿病、动脉硬化、脂肪肝、高脂血症等代谢综合征,影响人们的健康与寿命[2]。已知人体消化道内存在数量约1014的微生物,其基因组数量是人体的150倍以上[3]。研究显示,肠道菌群可影响宿主健康,有肥胖倾向的人肠道内菌群更易从食物中吸收热量,导致肥胖相关菌群在肠道中热量吸收效率增加,引起相关慢性炎症,提高肠道通透性,造成内毒素入血,并最终导致肥胖及代谢综合征[4-6]。n-3多不饱和脂肪酸 (n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3PUFAs)是一种多不饱和脂肪酸,其第1个不饱和键出现在碳链甲基端的第3位,具有心血管保护和免疫调节等作用。研究发现,肥胖症患者血浆及脂肪组织n-3 PUFAs含量减少[7],补充-3PUFAs可减轻肥胖患者的体重,改善代谢综合征[8],但其对肠道菌群是否有调节作用目前尚不十分清楚。本研究观察了补充n-3PUFAs对高脂饮食大鼠肠道菌群及门静脉血内毒素水平的影响,探讨了其改善肥胖及代谢综合征的可能机制。

材料和方法

实验动物及分组无特定病原体级4周龄雄性SD大鼠40只 (4只实验中灌胃未成功,于后期剔除),体重 (102.1±6.1)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,适应性喂养3 d后随机分为分为普通饮食组(CD,n=10)、高脂饮食组 (HFD,n=10)、普通饮食+n-3PUFAs组 (CD+n-3PUFAs,n=7)、高脂饮食+n-3PUFAs组 (HFD+n-3PUFAs,n=9)4组,其中,CD+n-3PUFAs组与HFD+n-3PUFAs组每天经胃给予n-3PUFAs[主要为二十二碳六烯酸 (docosahexenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸 (eicosapentaenoic acid,EPA),按照1000 mg/(kg·d)给予,由北京百慧生化制药公司提供],其他两组则给予相应量的生理盐水。4组大鼠均喂养10周,每周记录体重变化。

饲料配方及供能比普通饲料:为大鼠维持料,富含常规营养成分,能量密度13 769 kJ/kg,其中碳水化合物∶脂肪∶蛋白供能比例为63.3%∶12.3%∶24.4%。高脂饲料:由普通饲料加工而成,能量密度18 540 kJ/kg,碳水化合物∶脂肪∶蛋白供能比例为33.0%∶50.0%∶17.0%,质量比为36.7%∶24.5%∶19.1%。普通饲料及高脂饲料均由北京科澳协力饲料有限公司加工。

粪便DNA提取喂养10周后,无菌镊取新鲜成形大便置入无菌冻存管中,保存于-80℃冰箱中待检。为了分析肠道菌群组成,通过粪便DNA提取试剂盒(OMEGA,D4015-01)提取粪便总DNA,置于-20℃以便于分析。采用NanodropTM1000(美国Thermo Scientific公司)测定所提取的粪便DNA浓度及纯度。

Real-time PCR测定肠道菌群组成肠道细菌的PCR引物见表1,采用不同引物将提取的粪便DNA扩增,并稀释为 (10-1~1.00) ×1010copies。采用Bio-Rad CFX96(美国BIO-RAD)荧光定量PCR仪,通过2-△△CT法进行相对定量分析,制作copies与CT值之间的标准曲线 (每种细菌及总DNA都要制作标准曲线),然后以提取的DNA样本为模版,进行定量PCR,通过标准曲线计算样本中每种细菌的copies,通过不同细菌编码16S rRNA的基因copies与总DNA copies的比值计算其相对含量。每个样本重复3次取平均值。

血清内毒素的测定经1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后,将大鼠固定在操作台上,剃除大鼠腹部毛发,消毒后正中切口逐层进入腹腔,拨开横结肠、肝脏及胃,暴露门静脉。用注射器吸取血液抗凝剂 (厦门鲎试剂实验公司)1 ml于无热原试管中,一手固定门脉周围组织,一手用无热原注射器准确抽取门静脉血1 ml注入试管中,和抗凝剂混匀,4℃下3000 r/min(r=190 mm)离心5 min,吸出上清液于-20℃冰箱中密封保存。采用改良偶氮基质显色鲎试剂盒 (厦门鲎试剂实验公司)进行定量检测内毒素水平。

统计学处理采用SPSS 12.0统计软件,计量资料以均数±标准差表示,组间均数比较采用独立样本t检验,多组比较采用单因素方差分析;计数资料采用率表示,组间比较采用χ2检验;所有P值均为双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。

表1 Real-time PCR测定肠道菌群的引物Table 1 Primers used for bacterial quantification by real-time PCR

结 果

体重变化情况实验开始前,CD组、HFD组、CD+n-3PUFAs组、HFD+n-3PUFAs组大鼠的平均体重分别为 (99.6±4.2)、 (103.2±7.4)、 (101.2±5.5)、 (103.4±6.4)g,各组间差异无统计学意义(P=0.613)。饲养10周后,HFD组大鼠的体重达到(660.5±26.3)g,明显高于CD组的 (574.0±23.5)g(P=0.0002),CD+n-3 PUFAs组的 (529.2±41.1)g(P=0.0001)和HFD+n-3PUFAs组的 (609.2±25.9)g(P=0.022),CD组与CD+n-3PUFAs组间差异无统计学意义 (P=0.42)(表2)。

肠道菌群检测结果饲养10周后,CD、HFD、CD+n-3PUFAs、HFD+n-3PUFAs组大鼠的粪便中DNA含量分别为 (68.29±45.20)、(42.32±36.33)、(76.13±41.88)、(29.35±26.91)ng/mg粪便,各组间差异无统计学意义 (P=0.076)。HFD组大鼠粪便中厚壁菌门 (P=0.002)和肠杆菌科 (P=0.022)的含量明显高于CD组大鼠,拟杆菌门 (P=0.026)和双歧杆菌属 (P=0.034)含量明显低于CD组。CD+n-3PUFAs组大鼠粪便中的拟杆菌门含量明显高于CD组 (P=0.043)。HFD+n-3PUFAs组大鼠粪便中的厚壁菌门含量 (P=0.044)和肠杆菌科含量 (P=0.012)明显低于HFD组,拟杆菌门含量明显高于HFD组 (P=0.042)(表3)。

血清内毒素检测结果饲养10周后,CD、HFD、CD+n-3PUFAs、HFD+n-3PUFAs组大鼠的内毒素分别为 (0.045±0.014)、(0.074±0.025)、(0.038±0.017)、(0.052±0.019)EU/ml,其中,HFD组明显高于CD组 (P=0.007),HFD+n-3PUFAs组明显低于HFD组(P=0.042),CD+n-3PUFAs组与CD组差异无统计学意义 (P=0.210)。

表2 各组大鼠体重变化情况的比较 (x±s,g)Table 2 Comparison of body weights among four groups(x±s,g)

表3 各组肠道菌群含量的比较 (x ± s,%)Table 3 Comparison of gut microbiota contents among four groups(x ± s,%)

讨 论

肠道菌群是肥胖研究的热点之一,虽然已有大量研究证实肠道菌群在代谢能量中的作用,但目前仍对肠道菌群缺乏足够的认识。饮食是导致肥胖的重要因素,动物实验结果显示高脂饮食可引起内脏性肥胖[8-9]。高脂饮食 (脂肪供能占50%)饲养小鼠12周后可比普通饮食组小鼠增加60%的脂肪含量[10]。本研究结果亦显示,高脂饮食 (脂肪供能占50%)可使大鼠体重明显增加,而补充n-3PUFAs可减少体重,提示n-3PUFAs可能具有治疗肥胖的作用。

肥胖涉及多种肠道菌群的改变,本研究选择了常见的几种与肥胖相关的细菌作为研究对象。由于取材原因,分析小肠内菌群的组成比较困难,大多数研究集中在分析粪便或者结肠内容物中的肠道菌群来反映肠道的菌群组成[5,11-12]。人和鼠肠道菌群90%以上为革兰阳性厚壁菌门、革兰阴性拟杆菌门。饮食因素是肠道菌群改变的主要原因,高脂饮食能引起厚壁菌门增多而减少拟杆菌门[13]。但有关肠道菌群主要两种菌属厚壁菌门和拟杆菌门在肥胖个体之间的含量仍有争议[12,14-15],这是因为由于个体饮食、行为及环境因素难以控制,甚至是在DNA提取过程中的偏差,导致不同的研究结论可能不一致。研究发现,肠道内厚壁菌门多于拟杆菌门会引起机体吸收食物中热量的增加,从而引发肥胖[5]。本研究结果显示,高脂饮食可引起肠道菌群紊乱,表现为厚壁菌门含量增高,而拟杆菌门含量降低,与国外研究结果类似[16-17],虽然补充n-3PUFAs的剂量不同,结果仍显示n-3PUFAs可调节肠道菌群,在高脂饮食情况下尤为明显。

本研究结果发现,高脂饮食可引起双歧杆菌属的降低。已知粪便中双歧杆菌属含量可受膳食中纤维素的影响,推测本研究采用的高脂饮食中纤维素含量低可能是导致双歧杆菌属含量降低的原因。有研究显示,补充油酸可以增加肠道内双歧杆菌属的含量,但n-3PUFAs的作用不显著[16]。本研究也发现,n-3PUFAs增加双歧杆菌属含量的作用不明显,但单独补充双歧杆菌属有改善肥胖相关代谢综合征的作用[18],因此推测其改变可能与肥胖相关。

研究显示,肥胖症患者和动物的血清或脂肪组织中炎症因子升高[19],这些炎性因子在肥胖合并代谢综合征中发挥重要作用。革兰阴性细菌的产物内毒素被认为是启动肥胖相关炎症的重要因素之一,Ghoshal等[20]研究发现,不同种类脂肪酸对内毒素吸收可发挥不同的作用。高脂饮食中过多饱和脂肪酸的摄入可导致肠道微生物构成发生改变,损伤肠黏膜屏障,引起内毒素入血,刺激肥胖相关低度炎症及代谢综合征[21]。肠杆菌科分解可以产生内毒素,高脂饮食增加肠杆菌科含量。高脂饮食同时补充n-3PUFAs可以显著降低门静脉血内毒素水平,调节产生内毒素的革兰阴性菌肠杆菌科的含量。

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