质型多角体病毒侵染、转录调节机制的研究进展

靳 亮，彭 晗，王金昌，张莉莉，张 婷

(1.江西省科学院微生物研究所，330029，南昌；2.南昌大学生命科学与食品工程学院，330077，南昌)

质型多角体病毒侵染、转录调节机制的研究进展

靳 亮1，彭 晗2，王金昌1，张莉莉1，张 婷1

(1.江西省科学院微生物研究所，330029，南昌；2.南昌大学生命科学与食品工程学院，330077，南昌)

质型多角体病毒(Cytoplasmicpolyhedrosisvirus，CPV)隶属呼肠孤病毒科Reoviridae质型多角体病毒属Cypovirus，通常基因组由10个节段双链RNA构成。根据病毒基因组dsRNA片段在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中电泳图谱的差异，目前CPV已被分为20个电泳型。依据已有的研究结果，综述了质型多角体病毒(Cypovirus， 简称CPV)侵染、转录调节机制的最新研究进展。重点分析了CPV入侵过程；转录过程中CPV衣壳蛋白VP1和塔状蛋白VP3构象变化，促进mRNA起始转录和加帽的作用；大突起蛋白VP5，作为夹状蛋白起到稳定CPV病毒粒子结构的作用；另外，VP5作为mRNA分子伴侣，促进RNA链的解旋和加速链的退火。这些研究结果将为下一步深入研究CPV入侵、转录机制，提供了重要的理论依据和研究线索。

质型多角体病毒；病毒入侵；病毒转录；结构蛋白

0 引言

质型多角体病毒(Cytoplasmicpolyhedrosisvirus)属于呼肠孤病毒科，质型多角体病毒属。根据病毒基因组dsRNA片段在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中电泳图谱的差异，目前CPV已被分为20个电泳型[1-2]，电泳型之间至少有3个基因节段的迁移率不同。

随着结构生物学与信息处理等新技术的运用与发展，包括X射线晶体衍射、低温电镜与三维重构技术，质型多角体病毒结构学研究方面已取得突破性进展[3]。采用冷冻电镜和计算机三维重构技术研究病毒颗粒表明：CPV为单层衣壳，它的衣壳蛋白主要由3种结构蛋白组成，分别是衣壳蛋白CSP(Capsid shell protein )、塔式突起蛋白TP(Turret protein)及大突起蛋白LPP(Large protrusion protein)[4]。Yu[5]等利用低温电子显微镜技术在分辨率上研究了衣壳蛋白的三维结构，在与基因组直接作用的区域中观察到螺旋与β发卡结构之间的构象改变，同时发现了特有的加帽结构和释放通道。Cheng[6]等通过低温电子显微镜研究发现，CPV的五聚体塔状蛋白的酶区域是拓扑结构高度保守并且有5个连接着鸟苷酰基转移酶和甲基转移酶区域的独特的通道；通过氨基酸序列推理，LPP是由S7片段编码P50蛋白修饰后得到的。Yang[7]等研究发现：当CPV病毒粒子进行转录时，衣壳蛋白VP1A、VP1B和塔状蛋白VP3构象发生变化，衣壳空间扩大和塔状蛋白周围通道的加宽，使得基因组RNA从紧凑的病毒粒子衣壳更加灵活的转录和输出。

本文依据已有的研究结果，对CPV最新入侵机制和转录相关结构蛋白的研究进展进行综述，为今后深入研究CPV的入侵和转录提供参考。

1 质型多角体病毒对中肠细胞的侵染

家蚕质型多角体病毒1型(BmCPV-1)，能够感染家蚕，因此是一种重要的农业病原物[8-9]。由于其刚性、高产和特殊的表面结构，BmCPV病毒粒子常常作为模式材料，通过冷冻电镜用以研究其高分辨率结构和单粒子组成[5,10-11]。

BmCPV宿主细胞是家蚕幼虫的中肠细胞。将家蚕幼虫喂饲侵染BmCPV的桑叶后，在感染后不同时间点，收集感染家蚕的中肠并制备超薄电镜切片。电镜观察结构显示：病毒粒子感染中肠3 h后，在中肠细胞的内外均可以检测到病毒粒子的存在；并且纤维围食膜不能阻止病毒粒子的入侵。病毒粒子粘附到微绒毛表面，穿透细胞质膜，最终进入到微绒毛细胞。随着病毒粒子的嵌入，细胞质膜仅仅在病毒粒子入侵处出现不连续穿透点，而没有发现明显的细胞质膜大面积破坏。当病毒粒子在入侵时，保存了其二十面体结构的完整性。既然没有检测到细胞质膜内陷和含有病毒粒子的细胞质囊泡，Liu[8]等排除了病毒粒子通过胞吞作用进入细胞的可能性，并总结了BmCPV病毒粒子入侵柱状中肠细胞过程如下：最初，通过病毒粒子的刺突蛋白，病毒粒子识别和吸附到微绒毛的细胞质膜上；然后与细胞质膜相互作用，导致了仅仅是可识别的细胞质膜位点性破坏；最终，病毒粒子穿透微绒毛，并侵入到柱状细胞的细胞质中。

(a)微绒毛的横截面图：显示CPV病毒粒子进入中肠柱状细胞的不同状态，Mv：微绒毛；(b)在肠腔和杯状细胞的细胞质中的CPV病毒粒子，GC：杯状细胞，CP：细胞质突起，GCh：杯状腔；(c)分布在中肠肌细胞的细胞质的肌原纤维中的CPV病毒粒子，MC：肌肉细胞

2 质型多角体病毒的转录调节机制相关的结构蛋白研究进展

近年来运用X射线晶体衍射及低温电镜与三维重构技术，对呼肠孤病毒核心蛋白与完整颗粒结构高分辨率的解析，不仅揭示了呼肠孤病毒核衣壳蛋白所具有的转录酶活性，同时阐明了内源性RNA转录与调节的结构基础。最近，Cheng等发现，在CPV的mRNA转录过程中，结构蛋白VP1和VP3经过构象的改变，导致核衣壳腔变大和核酸通道变宽，便于mRNA的转录和加帽。但是没有检测到VP5结构的变化。

通过冷冻电镜，Yang[7]等发现，在许多CPV病毒粒子的周围有可见的链状物质(如图2(a)的箭头所示)。从转录CPV中，可以观测到链状的物质，而在非转录CPV中没有发现这种链状物(图2(a))。结构学分析发现，转录CPV与非转录CPV整体的核衣壳结构相似；但是前者的塔状蛋白顶端缺失了刺突蛋白复合物(图2(b))。通过冷冻电镜，Yang等清晰的观测到CPV病毒粒子的60%以上侧链，并在此基础上构建了所有主要衣壳蛋白的完整结构骨架 (图2(c)和图2(d))。为了研究核衣壳在mRNA转录过程中结构的变化情况，Yang等把转录CPV和非转录CPV密度图进行叠加(图2(e))。叠加图显示主要不同之处是位于五倍轴区域(图2(e))。通过仔细检测发现，VP1A、VP1B以及塔状蛋白VP3构象发生改变，而大突起蛋白VP5并没有检测到蛋白的改变。

2.1核衣壳蛋白VP1及其相关结构的构象变化

核衣壳蛋白VP1是由VP1A和VP1B 2个异构体组成，每个异构体由4个部分组成：顶端部分(439～775 aa)，壳部分(134～438 aa，790～825 aa，963～1 070 aa，1 237～1 333aa)，二聚体区域(1 071～1 236 aa)和突状区域(825～962 aa)。转录CPV与非转录CPV结构比较揭示：VP1A和VP1B结构变化主要在顶端区域(图3(a))。在转录CPV中，VP1A的顶端区域向塔状蛋白倾斜。顶端区域倾斜类似一个铰链运动。VP1B结构的变化要比VP1A的小，其主要构象变化发生在顶端区域的尖端部分。

在转录CPV中，核衣壳蛋白VP1结构的2个变化，促进了mRNA转录。首先，VP1A顶端区域的倾斜为mRNA转录提供更大空间。空间的扩大促使RNA有更大的灵活性，并从紧致的核衣壳中释放。其次，2个相连的VP1A与其毗邻的2个VP1B形成的周围通道变得更加宽阔(图3(c)和图3(d))。这个通道不是垂直于核衣壳的表面而是与核衣壳有30°的斜角。这个通道在形状上是不规则的，直径大约为9～15 Å，然而非转录CPV通道直径只有6～10 Å。然而，非转录CPV通道被VP1的Arg 653所阻塞(图3(c))。另外，用于阻塞非转录CPV的核衣壳5倍轴处的五聚体通道的小节状结构在转录CPV中也有观测到(图3(e))。因此，这个小节状结构隶属于RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，推测是RdRp被铆钉在核衣壳上。在转录CPV中存在小节状结构，这排除了五聚物通道作为起始mRNA释放通道的可能。因此，周边通道成为连接核衣壳内腔和塔状区域的唯一通道。通过冷冻电镜对正呼肠孤病毒粒子的RdRp晶体结构进行定位，Zhang[12]等推断，当转录发生时，周围通道变宽使得起始mRNA进入塔状蛋白区域。转录CPV中，VP1蛋白结构变化也为上述推断提供了直接证据。这说明呼肠孤病毒科中某些病毒采用了周边通道释放mRNA。

(a)CPV冷冻电镜照片(黑色箭头指示转录出的可见的链状物质)；(b)CPV的径向彩色表面阴影图；(c)叠加到原子模型的衣壳蛋白的α-螺旋密度图；(d)叠加到原子模型的衣壳蛋白的β-折叠的密度图；(e)转录CPV(黄色)叠加非转录CPV(蓝色)的结构示意图

图2 CPV核衣壳的整体结构

(a)转录CPV的VP1A(黄色)与非转录CPV的VP1A(蓝色)的叠加图；(b)转录CPV的塔状蛋白(黄色)与非转录CPV的塔状蛋白(蓝色)的叠加图；(c)左边：VP1A的2个拷贝(红色)和VP1B的1个拷贝(蓝色)在转录CPV中叠加密度图；右边：VP1A的2个拷贝(红色)和VP1B的一个拷贝(蓝色)在非转录CPV中叠加密度图；(d)1个周边通道的定位(这个周边通道是由VP1A(红色)和VP1B(绿色)形成的)；(e)转录CPV的塔状蛋白显示：1个小结状的结构，在五倍轴上封堵了五聚物通道

图3 CPV衣壳蛋白

2.2塔状蛋白VP3在转录过程中的构象变化

转录CPV与非转录CPV的VP3结构比较发现，结构变化表现在355 aa(苯丙氨酸，Phe)的关键运动[7]。这个关键运动促使7-N-甲基转移酶(7-N-MTase)、2′-O-甲基转移酶(2′-O-MTase)和连接桥的移动。VP3的另一个结构变化发生在鸟苷酰转移酶区域的279～309残基处，其中包括1个环和1个α螺旋(图4(a))。除此之外，没有发现其他重要的结构变化。维持刚性结构对于保护酶的活性，具有重要作用。VP3的作用是催化mRNA加帽过程中的后3个反应：GTase，7-N-MTase和2′-O-MTase。相应的VP3是由4个功能域组成：GTase区、7-N-MTase与2′-O-MTase，支撑域和连接桥(用于连接鸟苷酰酶和2个甲基转移酶)。VP3结构变化使得塔状蛋白从相对紧致状态变成开放状态，类似一朵花盛开的过程。这种结构变化促使通道将GTase域和7-N-MTase域连接，使得mRNA的通路变宽(图4(b))，对于mRNA加帽起到重要作用。在非转录CPV中，刺突蛋白复合物被固定在支撑区域，而转录CPV的VP3结构变化，使其支撑区域不能固定刺突蛋白复合物(图4(b))。

2.3塔状蛋白VP3的GTase域的GMP直接观察

在转录CPV中，Yang[7]等发现了一个超高密度区，位于袋状VP3 GTase功能域的中心(图4(c))，这个超高密度区在非转录CPV中没有被发现。生化数据表明，正呼肠孤病毒塔状蛋白的GTase起功能作用的区域，是将GMP区域转到5′-双磷酸化的起始mRNA的5′末端。这个转移反应通过位于GMP和塔状蛋白的赖氨酸的磷酰胺共价键实现[13]。由此，Yang等推断转录CPV中特有的这个致密区就是GMP功能域；而且，GMP原子模型与该密度非常吻合并且GMP结构(图4(c))和邻近Lys234残基的长度与磷酰胺共价键的长度一致(图4(d))。GTase域就像一个口袋一样，而GMP部分恰恰位于它的中心部位。Yang等没有发现一个明显套装结构引导mRNA 5′末端从环绕通道的出口到GTase功能域，但是在塔形蛋白的5个GTase区的GMP部分明显的增加了mRNA 5′末端GMP转移的机会。

生物化学和突变分析揭示，正呼肠孤病毒塔状蛋白λ2的Lys190对磷酰胺键的产生是必须的。并且，Lys171对于磷酰胺键也有重要的贡献。以前的研究显示，Lys190位于KDLS序列中，与KDLS相似序列在呼肠孤病毒科(比如轮状病毒属、环状病毒和植物呼肠孤病毒属)中是十分保守的。但是，与正呼肠孤病毒λ2蛋白的KDLS序列比较，CPV VP3蛋白的KILE序列是部分保守的。另外，KILE序列位于VP3的α螺旋处，而KDLS位于λ2蛋白的环状区域(图4(e))。这就意味着促进磷酰胺键形成的GTase酶域中赖氨酸的位置在呼肠孤病毒科不同病毒属中是不同的。通过转录CPV的VP3叠加在正呼肠孤病毒λ2蛋白，Yang等发现正呼肠孤病毒λ2蛋白的2个赖氨酸正好定位于CPV GTase功能域GMP部分的附近(图4(e))。

2.4大突起蛋白VP5的功能研究

Hagiwara and Naitow[14]发现在感染BmCPV的BmN4细胞和家蚕中肠样品中，用抗体(GST-p50C265抗体)都能够检测到56kDa的p50蛋白；而在检测纯化的病毒粒子蛋白时，只发现了4种分子量相近的蛋白VP5(34，36，38和40kDa)，推蛋白合成后经过修饰的结果。

(a)转录中的CPV的VP3(黄色)与非转录中的CPV的VP3(蓝色)叠加图；(b)转录中CPV与非转录CPV的塔状蛋白的比较；(c)VP3 GTase功能域与它的原子模式图叠加的密度图的墙眼立体视图(透明的)；(d)GMP的放大图；(e)转录中的CPV的VP3 GTase功能域与正呼肠孤病毒的λ2蛋白的GTase部分的叠加图测这些蛋白是p50

图4 塔状蛋白VP3

Cheng[5]等人的研究结果显示：质型多角体病毒结构蛋白VP5构成了病毒粒子的大突起蛋白(LPP)。120个大突起蛋白定位在CPV核衣壳的外表面。这种类似的突起蛋白也存在于所有的塔状呼肠孤病毒的内层衣壳表面，作为一种钳状蛋白强化核衣壳的稳定性[15-16]。VP5蛋白是由CPV genome S7片段编码。LPP是p50蛋白的切割产物，其中包括290 aa个残基组成的(由3～292 aa构成)。在病毒复制过程中，首先合成的是结构蛋白p50(50kDa)，随着病毒粒子的包装，p50发生切割生成VP5(31kDa)[17]。这种蛋白发生切割的现象与轮状病毒VP4有些相似。轮状病毒在水解过程中VP4(88kDa)被切割成VP8(28kDa)与VP5(60kDa)2种亚单位蛋白，切割产物在病毒粒子内仍互相连接[18-19]，从而增强了病毒的感染力，然后病毒才能穿入宿主细胞。另外，在人呼肠孤病毒MRV入侵宿主细胞过程中也有类似的现象[20]。

尽管Yang[7]等把转录CPV和非转录的CPV密度图进行叠加(图2(e))，发现大突起蛋白VP5并没有检测到蛋白的改变，认为VP5起固定CPV病毒粒子结构的作用。但是Zhou和他的研究团队最新研究发现[21]，通过对Helicoverpaarmigeracypovirus-5(HaCPV-5)结构蛋白VP5真核表达研究发现：结构蛋白VP5具有RNA分子伴侣活性，能够促进RNA解旋并加速链的退火。更进一步的研究发现，VP5的解旋活性是只针对RNA，缺乏导向性，并且其活性受二价金属离子(Mg2+，Mn2+，Ca2+或者Zn2+)不同程度的抑制。更重要的是，HaCPV-5 结构蛋白VP5能够通过CPV平底锅状RNA模板，促进逆转录酶的起始转录。

3 质型多角体病毒的入侵和转录相关结构蛋白研究进展的启示

由于病毒粒子入侵中肠柱状细胞时，病毒粒子的刺突蛋白首先识别和吸附到微绒毛的细胞质膜上。那么刺突蛋白与微绒毛上的受体蛋白存在相互识别机制，可以通过酵母双杂交的方法，构建DpCPV基因组10条片段的酵母双杂交cDNA文库和甜菜夜蛾幼虫中肠基因组的酵母双杂交cDNA库,探寻CPV蛋白是由哪个片段编码，并且寻找与CPV刺突蛋白有相互作用的昆虫中肠蛋白；通过免疫沉淀的方法，对有相互作用的蛋白做进一步验证，为下一步深入研究CPV入侵机制打下基础。

当CPV发生转录时，VP1和VP3的空间结构的变化促使转录空间扩大，RNA链的合成和输出更加容易。新合成的mRNA链，在经过塔状蛋白的糖基化酶、7-N-甲基化酶和2′-O-甲基化酶作用下的高度协调的加帽过程[6]。那么mRNA的转录也是在结构蛋白VP1、VP3、VP5以及RdRP的密切协作过程完成的。随着下一步研究的深入，CPV的转录过程也将被详细解读。

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AdvancesintheStudyofInfectionandTranscriptionMechanismofCytoplasmicPolyhedrosisViruses

JIN Liang1,PENG Han2,WANG Jinchang1,ZHANG Lili1,ZHANG Ting1

(1.Institute of Microbiology,Jiangxi Academy of Sciences,330029,Nanchang,PRC;2.School of Life Sciences and Food Engineering,Nanchang University,330077,Nanchang,PRC)

Cytoplasmicpolyhedrosisviruses(CPVs) belong to the genus Cypovirus in the family Reoviridae,and are divided into 19 distinct electrophoretypes on the basis of variation in the electrophoretic migration patterns of genome segments.Based on existing data,advances in the study of infection and transcription mechanism of cytoplasmic polyhedrosis viruses were summarized.We mainly emphasized on the infection process of CPV,conformational Changes in Capsid Shell Protein VP1 and Turret Protein VP3 in transcribing CPV cryo-EM images,and large protrusion proteins (VP5) serve as clamp proteins that enhance the stability of the capsid shell.At the same time,VP5 displays the RNA chaperone-like activity that destabilizes RNA helices and accelerates strand annealing.These results help us to understand the mechanism of infection and transcription of CPV.

cytoplasmicpolyhedrosisviruses(CPV);virions infection;transcription;structural proteins

2014-05-19;

2014-06-25

靳 亮(1979-)，男，博士，助理研究员，目前从事昆虫病毒分子生物学研究及生物农药产业化推广工作。

国家自然科学基金项目(No.31260031)；江西省青年科技基金项目(No.2011523040005)；江西省科学院引进博士项目。

10.13990/j.issn1001-3679.2014.04.021

Q93

A

1001-3679(2014)04-0509-06