人pEGFP-GEF-H1载体的构建及其表达*

徐卫东 钱元霞 曹 俊

江苏大学药学院1(212013) 南京大学医学院附属鼓楼医院消化科2

鸟嘌呤核苷酸交换因子-H1(guanine nucleotide exchange factor-H1, GEF-H1)是Ren等[1]于1998年从人肝癌HeLa细胞cDNA文库中筛选出来的Db1家族成员，其编码分子质量为100 kDa (1 Da=0.992 1 u)的蛋白，包含有C1(含有锌指基序)、DH和PH(两区域串联)、卷曲螺旋C末端等几个区域，其中DH区域是与G蛋白主要作用的功能区。GEF-H1能刺激RhoA的鸟嘌呤核苷酸交换，研究表明其在多种肿瘤细胞中表达并可促进细胞周期增殖，促进细胞的运动和转移等。本研究通过构建人pEGFP-GEF-H1载体，并稳定转染结肠癌HCT116细胞后检测GEF-H1的表达水平，旨在为进一步探讨其在结肠癌发生、发展中的作用奠定基础。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

限制性内切酶PacⅠ和T4DNA连接酶(New England Biolabs Inc.)，XhoⅠ、EcoRⅠ、BgLⅡ(Takara)，KOD-Plus-(TOYOBO)，质粒小量提取试剂盒和无内毒素质粒大提试剂盒(OMEGA)，T4DNA聚合酶和SAP(MBI Fermentas)，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen)，DL2000(广州东盛生物科技有限公司)，真核表达载体pEGFP-C1(BD公司)，大肠杆菌DH10B(Eppendorf公司)，结肠癌HCT116细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，Trizol RNA提取试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]，脂质体转染试剂Neofectin(Mid Atlantic Biolabs, Inc)，RT-PCR试剂盒(Fermentas公司)，鼠抗人GEF-H1单克隆抗体(Abcam公司)，羊抗小鼠IgG-HRP(武汉博士德生物工程有限公司)，ECL超级发光液(碧云天生物技术研究所)。

TS100 Nikon倒置相差显微镜(Nikon公司)；Mini-PROTEAN 3电泳系统、Bio-RAD 525BR电泳仪(Bio-Rad公司)。

二、研究方法

1. 全基因合成人GEF-H1：XhoⅠ/EcoRⅠ克隆表达载体pEGFP-C1，pEGFP位于GEF-H1的N端，融合表达。根据GenBank的序列(AF486838)，使用在线合成引物设计软件(http://helixweb.nih.gov/dnaworks)，合成引物，设计GEF-H1(1～160)的160条引物，行重叠PCR扩增，反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 60 min，25个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃ 3 min。

2. 目的片段的纯化回收：琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，DNA快速纯化回收试剂盒回收目的片段，具体操作按产品说明书进行。

3. 构建人pEGFP-GEF-H1载体：利用基因中单一酶切位点BgLⅡ(AGATCT)，XhoⅠ/ BgLⅡ和BgLⅡ/EcoRⅠ分别双酶切PCR回收产物GEF-H1-F1和GEF-H1-F2；XhoⅠ/EcoRⅠ双酶切载体pEGFP-C1。按比例用T4连接酶连接，16 ℃ 16～20 h。

4. 感受态细菌的制备和转化：电转化感受态细菌DH10B并扩增，SOC培养基振荡1 h后涂布于加有Kana(50 mg/L)的LB平板，37 ℃过夜。挑取单克隆，行菌落PCR验证，GEF-H1引物上游：5’-CAG TCC TCG AGC CAT GTC TCG G-3’，下游：5’-GCG GTG ATC TCA GCT GAT TTC CAT TTC GAT CCC TCT GGC TA-3’，片段长度2 983 bp。筛选阳性克隆并扩增，质粒抽提试剂盒抽提，取10 μL质粒送金斯瑞生物科技有限公司测序验证。

5. 脂质体转染结肠癌HCT116细胞：取6孔培养板，每孔加入2 mL含对数生长期4×105个细胞的培养液，培养至70%～80%汇合时，行后续实验。将结肠癌HCT116细胞分为实验组、空质粒组，分别转染重组质粒pEGFP-GEF-H1、空质粒，以未转染的细胞作为空白对照。转染24 h后，各孔加500 μg/mL G418行筛选，培养3 d后药物浓度降至200 μg/mL，维持筛选至16 d，挑选G418抗性的细胞单克隆，单克隆长到相对较大的集落后，接种于24孔板。继续培养，约4、5 d后即可消化传代，转移至培养瓶，荧光显微镜下观察细胞转染情况。

6. RT-PCR鉴定GEF-H1 mRNA表达：按Trizol RNA提取试剂盒操作说明提取总RNA，逆转录合成cDNA，行PCR扩增。GEF-H1引物上游：5’-GAT GAA GGA AGC CAA GGA TG-3’，下游：5’-CCA GCA ATG TTG GTG GTA GA-3’，扩增片段389 bp；以β-actin作为内参，上游：5’-CGA GCG GGA AAT CGT GCG TGA CAT TAA GGA GA-3’，下游：5’-CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC-3’，扩增片段479 bp。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃再延伸15 min。EB染色，PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察PCR产物的表达情况。

7. 蛋白质印迹法鉴定GEF-H1蛋白表达：提取各组细胞总蛋白，蛋白定量后样品按比例加入SDS凝胶上样缓冲液溶解，煮沸5 min。以20 μg蛋白进行上样，电泳，然后将蛋白转至PVDF膜，封闭液封闭1 h，一抗(工作浓度1∶3 000)孵育4 ℃过夜，二抗(工作浓度1∶1 000)室温孵育2 h，ECL发光液发光，暗室内X线片感光、显影、定影、观察。

结 果

一、鉴定GEF-H1基因

重叠PCR扩增结果显示，利用基因中单一酶切位点BgLⅡ(AGATCT)，将GEF-H1分成两段扩增，即GEF-H1-F1和GEF-H1-F2，大小分别为1 350 bp和1 654 bp(图1)。

M：DNA Marker；泳道1～3：GEF-H1-F1(1#-70#)；泳道4～6：GEF-H1-F2(71#-160#)

图1GEF-H1PCR扩增图

二、鉴定pEGFP-GEF-H1载体中目的基因

以XhoⅠ/ BgLⅡ和BgLⅡ/EcoRⅠ分别双酶切PCR回收产物GEF-H1-F1和GEF-H1-F2，XhoⅠ/EcoRⅠ双酶切载体pEGFP-C1，基因大小分别为1 350 bp、1 654 bp和4 700 bp(图2)。

M：DNA Marker；泳道1：GEF-H1-F1(1#-70#)；泳道2：GEF-H1-F2(71#-160#)；泳道3：pEGFP-C1

图2pEGFP-GEF-H1质粒行XhoⅠ/BgLⅡ和BgLⅡ/EcoRⅠ双酶切鉴定(PCR法)

三、大肠杆菌的转化和鉴定

挑取单克隆的转化菌接种培养，PCR法特异性扩增出2 983 bp的目的片段(图3)，表明重组质粒pEGFP-GEF-H1已转入所鉴定的大肠杆菌中。

M：DNA Marker；泳道1～6: GEF-H1(1#-160#，2 983 bp)

图3pEGFP-GEF-H1质粒导入大肠杆菌的PCR检测

四、pEGFP-GEF-H1质粒测序

质粒测序结果显示序列正确。

五、荧光显微镜下HCT116细胞转染情况

pEGFP-GEF-H1转染HCT116细胞24 h后，荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达(图4)，表明重组质粒转染细胞后能成功启动基因EGFP的翻译并表达有功能的绿色荧光蛋白，通过检测绿色荧光蛋白的成功表达可间接确定pEGFP-GEF-H1成功转染细胞。

六、RT-PCR检测转染HCT116细胞的GEF-H1 mRNA表达

经凝胶电泳成像分析，转染后的实验组细胞GEF-H1 mRNA表达量与空白对照组和空质粒组相比明显升高(图5)。

1：空白对照组；2：空质粒组；3：实验组

M：DNA Marker；泳道1：空白对照组；泳道2：空质粒组；泳道3：实验组

图5pEGFP-GEF-H1转染HCT116细胞后提高GEF-H1mRNA表达水平(PCR法)

七、蛋白质印迹法检测转染HCT116细胞GEF-H1蛋白表达

实验组HCT116细胞中GEF-H1蛋白表达较空质粒组和空白对照组明显升高(图6)。

1：空白对照组；2：空质粒组；3：实验组

图6pEGFP-GEF-H1转染HCT116细胞后提高GEF-H1蛋白的表达水平(蛋白质印迹法)

讨 论

近年研究发现Rho蛋白与肿瘤发生、发展、浸润、转移等过程有密切的关系[2-4]，主要引起肌动蛋白细丝等细胞骨架蛋白重构，从而维持细胞的形态极性，促进细胞的变形趋化运动和游走[5]。此外，Rho家族成员参与对细胞周期的调控、细胞应激反应的调节等过程[6-7]，Rho家族鸟苷三磷酸酶(Rho GTPases)具有两种形式：与GTP结合的活性形式和与GDP结合的非活性形式[8]。鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)可调节Rho GTPases蛋白的活性，促进GDP转换成GTP，因此可激活Rho GTPases，在白血病、p53突变型癌症、上皮细胞紊乱、传染病、心肌肥大等疾病中发挥重要作用，可调控细胞增殖、运动、侵袭、形态重要的骨架和信号组成蛋白[5,9-10]，因此GEF-H1基因可为癌症治疗提供新的靶点。本研究通过在线基因合成引物软件设计人GEF-H1基因引物，PCR法回收目的片段，大肠杆菌转化实验得到重组质粒pEGFP-GEF-H1，经鉴定构建成功。经脂质体转染结肠癌HCT116细胞后，通过RT-PCR和蛋白质印迹法发现GEF-H1高表达，表明转染成功。结直肠癌转移是影响患者疗效和预后并导致死亡的重要因素，是当前结直肠癌研究中最重要的方面，然而对于肿瘤细胞运动、侵袭和转移的生物学机制仍不明确。本研究通过构建高表达GEF-H1的结肠癌细胞株，旨在为进一步探讨结肠癌发生、浸润和转移与该基因的关系提供必要的实验材料。

1 Ren Y, Li R, Zheng Y, et al. Cloning and characterization of GEF-H1, a microtubule-associated guanine nucleotide exchange factor for Rac and Rho GTPases[J]. J Biol Chem, 1998, 273 (52): 34954-34960.

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