β-磷酸三钙对大鼠间充质干细胞诱导成骨分化

尹美珍，游佳清，何圣杰，王 杰，罗 婷，张正悬

(湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003)

β-磷酸三钙对大鼠间充质干细胞诱导成骨分化

尹美珍，游佳清，何圣杰，王 杰，罗 婷，张正悬

(湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003)

为了研究组织工程骨的种子细胞和β-磷酸三钙的骨诱导性，全骨髓法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCS)，倒置显微镜下观察显示BMSCS大量增殖，能被β-磷酸三钙诱导成骨分化，并受BMSCS接种密度的影响。在成骨分化过程中BMSCS表现为成骨细胞的形态和集落样生长行为，对硝基苯磷酸盐法和茜素红染色方法检测诱导后细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节形成，结果显示细胞分泌的碱性磷酸酶活性明显强于对照组，茜素红染色呈现红色结节。因此，BMSCS可作为骨缺损修复治疗的种子细胞，在适宜的接种密度下β-磷酸三钙能诱导其成骨分化。

骨髓间充质干细胞；成骨细胞；诱导分化；β-磷酸三钙

0 引言

成骨细胞的来源谱系有骨髓克隆形成单位、骨祖细胞和前成骨细胞。骨髓间充质干细胞(BMSCS)存在于骨髓，具有旺盛的增殖能力和很强的多向分化潜能。联合使用地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C能诱导BMSCS成骨分化[1-2]，在一定外界环境条件下BMSCS还能实现跨系统分化[3]。BMSCS在诱导条件下，具有成骨细胞相似的形态和生长特点，能分泌ALP，启动矿化[4]。近年来，有研究者通过中药有效成分探索其对BMSCS的成骨分化[5-8]，可通过诱导碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素的表达和钙化结节形成促进BMSCS的成骨分化。但是，现代临床医学在骨疾病及意外骨缺损的治疗上，需要采取手术治疗来修复骨组织。传统的移植方式有自体骨移植和异体骨移植，由于自体骨移植的来源有限而且对供骨部分有损伤，异体骨移植因免疫排斥反应等问题，都限制了临床的应用。现在的研究越来越多应用人工骨材料来修复骨缺损，尤其是研究组织工程骨，因而选择生物相容性好的材料以及种子细胞是最首要的环节。本文选择从来源丰富且采集方便的骨髓中提取骨髓间充质干细胞(BMSCS)作为种子细胞，研究生物相容性好的β-磷酸三钙对BMSCS的定向诱导成骨分化，为构建理想的组织工程骨提供依据。

1 材料和方法

1.1动物和主要试剂

6周龄SD大鼠，120～150g，购自湖北省疾控中心；DMEM/F12培养液购自Gibco 公司；新生胎牛血清购自杭州四季青生物技术公司；地塞米松和β-甘油磷酸钠购自上海研谨生物科技有限公司；碱性磷酸酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所；β-磷酸三钙由武汉理工大学生物材料与工程研究中心合成。

β-磷酸三钙浸提液的制作：将β-磷酸三钙粉末按1g∶10mL浸入含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液中培养，放入37 ℃、5%CO2培养箱中96 h，吸出浸提液，无菌封存，4 ℃冰箱保存备用。

1.2骨髓间充质干细胞的提取、分离和纯化

用全骨髓法分离提取间充质干细胞。将分离提取的全骨髓细胞用含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液培养，在培养箱中静置培养3 d后换液，以去除悬浮的杂细胞，再放回培养箱中培养，每3～4 d换液1次，重复数次。待细胞长满瓶底80%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，骨髓中一些不能增殖的细胞由于传代而死亡，因此可去除大量的杂细胞，BMSCS得以纯化。

1.3细胞密度对诱导成骨的影响

取生长良好的第4代BMSCS用胰蛋白酶消化后，以2×104/mL 、1×105/mL、2×105/mL密度接种于无菌6孔板中。每个接种密度的细胞均设空白对照组、磷酸三钙诱导组、阳性诱导组，每组3个复孔。在培养箱中培养24 h后，各组细胞换相应的培养液培养。空白对照组换DMEM/F12完全培养液，阳性诱导组换含地塞米松(10-8mol/L)、β-甘油磷酸钠(10mmol/L)以及维生素C(50μg/mL)的DMEM/F12完全培养液，磷酸三钙诱导组换β-磷酸三钙浸提液。以后每3～4 d换液1次，并逐日在倒置显微镜下观察细胞密度对诱导剂诱导成骨的影响。

1.4诱导成骨的细胞形态学观察

取生长良好的BMSCS，以1×105/mL密度接种于置有无菌盖玻片的6孔板中，分组以及处理细胞的方法同上。将细胞置于培养箱中进行连续培养，逐日观察诱导剂诱导成骨的细胞形态学变化。

1.5碱性磷酸酶的测定

倒置显微镜观察上述各组细胞，待6孔板内有细胞出现明显的集落样生长时，收集各组细胞反复冻融液样本，采用对硝基苯磷酸二钠盐比色法检测碱性磷酸酶活性，按照试剂盒说明操作。

1.6矿化结节的茜素红染色

上述各组细胞连续培养3周左右，磷酸三钙诱导组和阳性诱导组均出现肉眼所见的白色结节，在倒置显微镜下呈圆形或椭圆形的结节。取各组细胞爬片，用PBS冲洗3次，95%的乙醇固定10min。去离子水冲洗后，入0.1%茜素红染色30min。去离子水冲洗，晾干，封片，普通光学显微镜下观察。

1.7统计学处理

实验的计量数据使用SPSS10.0for Windows统计软件处理，统计分析用t检验。

2 结果

2.1不同细胞密度对间充质干细胞成骨分化的影响

细胞接种密度为2×104/mL时，细胞稀疏，细胞无明显增殖现象，并在培养过程中逐渐老化；细胞接种密度为1×105/mL时，细胞增殖现象明显，经过连续培养，磷酸三钙诱导组和阳性诱导组的细胞表现出集落样生长，并且在大约3周左右，形成了散在的细胞结节，而空白对照组细胞无明显的结节出现；细胞接种密度为2×105/mL时，细胞较密集，且增殖较快，各组细胞均匀长满整个培养板底，连续培养仍未见细胞结节。由此可见，细胞接种密度对BMSCS的成骨分化有明显的影响。

2.2间充质干细胞成骨分化的形态学变化

细胞培养3 d后，各组细胞形态无明显差别，细胞多为三角形和多角形，细胞之间通过伸出突起连接,骨髓间充质干细胞的形态 (100倍)如图1所示。细胞培养8 d后，阳性诱导组和磷酸三钙诱导组的细胞均呈集落样生长，细胞形态多变为梭形。随着培养时间的延长，2个诱导组集落内的细胞高度密集，细胞形态逐渐模糊不清，由于细胞不断分泌细胞外基质，进而被埋入其中，最终形成圆形或椭圆形结节，细胞钙化结节的形成(100倍)如图2所示。而空白对照组细胞长满瓶底，没有明显的成骨分化的形态学变化。

图1 骨髓间充质干细胞的形态 (100倍)

图2 细胞钙化结节的形成(100倍)

2.3间充质干细胞成骨分化后分泌碱性磷酸酶

BMSCS诱导后分泌的碱性磷酸酶活性测定结果如表1所示。由表1可知，阳性诱导组和磷酸三钙诱导组分别与空白对照组比较，2个诱导组细胞反复冻融液中碱性磷酸酶活性均明显增加(P<0.05)，说明β-磷酸三钙能促进BMSCS碱性磷酸酶的表达，与联合诱导剂无明显差别。

表1 BMSCS诱导后分泌的碱性磷酸酶活性测定

注：与空白对照组比较*P<0.05。

2.4矿化结节的茜素红染色

光学显微镜下观察阳性诱导组和磷酸三钙诱导组可见的细胞结节，用茜素红染色呈现红色，说明形成的细胞结节为钙化结节。茜素红染色细胞结节(40倍)如图3所示。

图3 茜素红染色细胞结节(40倍)

3 讨论

骨髓间充质干细胞具有自我复制和多向分化能力，在不同条件下可以分化为所有中胚层来源的组织，如成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等[9]。

骨髓间充质干细胞从增殖、分化为成骨细胞，并埋于细胞外基质，变为骨细胞，经历了一系列的分化过程。在体外环境下，BMSCS在向成骨细胞分化的过程中大致经历以下4个过程：

1)细胞增殖期。BMSCS大量增殖，并有细胞形态由三角形或多边形变成梭形。

2)细胞聚集期。细胞由原来单层细胞逐步向多层细胞生长，并且有一部分细胞开始合成细胞外基质蛋白I型胶原、纤维黏连蛋白。

3)钙化结节形成早期。随着细胞的不断聚集生长，细胞分泌碱性磷酸酶，合成并分泌大量细胞外基质蛋白将细胞包埋，碱性磷酸酶被认为是细胞外基质成熟的早期标志[10-11]。

4)钙化结节形成晚期。细胞外基质蛋白的不断合成和分泌，钙盐沉积，形成了矿化结节，茜素红染色结节呈现红色。本实验β-磷酸三钙与BMSCS作用后，细胞形态的变化、生长增殖的行为、碱性磷酸酶的分泌，以及茜素红染色呈红色的钙化结节的形成符合BMSCs成骨分化的过程。碱性磷酸酶的含量测定以及钙化结节形成的时间表明β-磷酸三钙单独诱导BMSCS的成骨分化与地塞米松、β-甘油磷酸钠以及维生素C联合诱导无明显差别。

4 结论

β-磷酸三钙可促进骨髓间充质干细胞分化，分化后的细胞具有成骨细胞的形态特点和生物学行为。骨髓间充质干细胞的成骨分化经历：①间充质干细胞大量增殖；②细胞生长聚集，并分化为成骨细胞；③细胞分泌细胞外基质以及碱性磷酸酶；④钙盐沉积，形成钙化结节，细胞成熟为骨细胞。β-磷酸三钙具有很好的诱导BMSCS分化成骨的能力，BMSCS可作为组织工程骨的种子细胞。

[1] 冯树梅,吴苑,骆靖峰,等.单层法诱导小鼠胚胎干细胞的成骨分化研究[J].新疆医科大学学报,2010,33(8):876-879.

[2] 盛辉,王洪复,高建军,等.不同浓度地塞米松诱导大鼠间充质干细胞向成骨细胞的分化[J].复旦学报(医学版),2003,30(2):164-166.

[3] 关春艳,高航.骨髓基质干细胞向心肌细胞分化的研究进展[J].心血管病学进展, 2009,30(6):1050-1053.

[4] 张本斯.SD大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养及分化的研究[D].成都:四川大学, 2003.

[5] 孙月娇,宋囡,何文智,等.左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导中转化生长因子β1及Smad2/3的影响[J].中国组织工程研究，2014,18(10):1496-1501.

[6] 徐凌霄,高俊,张前德. 左归丸含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化中碱性磷酸酶含量的影响[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(7):149-152.

[7] 刘钰瑜,姚卫民,艾春媚,等.大黄素对体外大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化的影响[J].中国临床药理学与治疗学,2005,10(2):191-195.

[8] 吴涛,徐俊昌,南开辉,等.淫羊藿苷促进羊骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(19):3725-3729.

[9] 庄洪,徐无忌.成骨细胞共育环境下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨特性[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(47):9283-9287.

[10] 王林红,樊立洁,谷志远,等.钛离子诱导骨吸收的现象及机制[J].国际口腔医学杂志,2009,36(4):441-443,447.

[11] 殷晓雪,陈仲强,党耕町,等.淫羊藿苷对人成骨细胞增殖与分化的影响[J].中国中药杂志,2005,30(4):289-291.

(责任编辑吴鸿霞)

Effects of β-tricalcium Phosphate on Osteogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rat

YinMeizhen,YouJiaqing,HeShengjie,WangJie,LuoTing,ZhangZhengxuan

(School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

Objective:to study seed cells and osteoinduction ability of β-glycerol phosphate for tissue engineering of bone.Method:bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCS) in rat were isolated and cultured with the method of whole bone marrow adherent.Results:inverted microscopy revealed that BMSCScould be mass cultured and be differentiated by β-tricalcium phosphate into osteoblast,but cell seeding density had some effect on induction of differentiation.In the course of osteogenic differentiation,BMSCSshowed a morphology of osteoblasts and biological behavior of colony growth.Nitrophenyl phosphate disodium salt assay and alizarin red staining method was used to determine alkaline phosphatase (ALP) activity and mineral node.The results showed that compared with those of the control group,ALP activity significantly enhanced and Alizarin red staining showed red nodules.Conclusion:BMSCScan be used as seed cells to be differentiated by β-tricalcium phosphate for bone tissue engineering.

bone marrow mesenchymal stem cells;osteoblasts;induced differentiation;β-tricalcium phosphate

2014-04-02

湖北理工学院2013年实验室开放基金项目。

尹美珍(1969— )，女，副教授，博士，研究方向：细胞生物学。

10.3969/j.issn.2095-4565.2014.04.013

R329.2+8

A

2095-4565(2014)04-0051-04