牛蒡苷元对H89诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

张囡，杨静娴，孙东，胡昱，赵丹，李红艳，康廷国

（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600）

·药学研究· PHARMACEUTICAL RESEARCH

牛蒡苷元对H89诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

张囡，杨静娴，孙东，胡昱，赵丹，李红艳，康廷国*

（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600）

目的：考察牛蒡苷元对H89诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法：用蛋白激酶A抑制剂H89处理SH-SY5Y细胞，建立细胞损伤模型。将SH-SY5Y细胞分成正常组（正常细胞）、模型组（经H89处理的细胞）、H89+牛蒡苷元组（经H89处理后给予牛蒡苷元处理的细胞）和H89+丹酚酸B组（阳性对照组，经H89处理后给予丹酚酸B处理的细胞）。采用MTT法检测细胞活力、免疫荧光细胞化学法检测细胞中β-淀粉样肽和神经营养因子-3的表达以及Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡率。结果：H89诱导的细胞损伤模型造模成功。牛蒡苷元在低浓度（0.5 μmol · L-1）时对细胞损伤模型的保护作用最佳，与模型组相比，H89+低浓度牛蒡苷元组细胞的细胞活力显著提高（P＜0.01），细胞中β-淀粉样肽的表达下调5.17%（P＜0.05），而神经营养因子-3的表达上调80.54%（P＜0.01），凋亡细胞百分比也显著降低（P＜0.05）。结论：低浓度牛蒡苷元对H89诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有显著保护作用。

牛蒡苷元；H89；SH-SY5Y细胞；细胞活力；β-淀粉样肽；神经营养因子-3；细胞凋亡

环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）是神经系统中一种重要的核转录因子，其经磷酸化（p-CREB）后即被激活，从而调节下游多种神经营养因子及促存活基因的转录，对神经细胞的成熟、存活和功能起着关键作用[1-3]。CREB可被多种信号通路激活，其中蛋白激酶A（PKA）信号通路是激活CREB的经典通路，而H89（N-[2-( p-bromocinnamylamino) ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide·2HCl hydrate）是PKA选择性抑制剂，可通过抑制PKA而抑制CREB的磷酸化，并诱导神经元损伤[4-5]。

菊科草本植物牛蒡（Arctium lappa L.）始载于《本草图经》，其药性辛、苦、寒，归肺、胃经，具有辛凉解表、疏风散热、宣肺祛痰、解毒消肿等功效。牛蒡苷和牛蒡苷元（Arctigenin，Arc）是其成熟干燥果实——牛蒡子中重要的药理活性成分，在体内，牛蒡苷转化为Arc而产生生物活性。已有研究报道Arc可在抗癌、免疫调节、抗炎和抗细胞氧化性损伤等方面发挥积极作用[6]，但其对损伤的神经细胞有无保护作用，却鲜有报道。本文采用PKA抑制剂H89抑制CREB磷酸化，建立人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤模型[4]，考察H89对SH-SY5Y细胞活力、β-淀粉样肽（β-amyloid, Aβ）和神经营养因子-3（neurotrophin-3，NT-3）表达以及细胞凋亡的影响，并初步探讨Arc对H89诱导的神经细胞损伤的保护作用及其机制。

1 材料与仪器

1.1 材料

SH-SY5Y细胞，首都医科大学宣武医院赠；H89（Cell Signaling 公司）；胎牛血清、DMEM/F12培养基（Gibco公司）；兔抗人Aβ35-42单克隆抗体（一抗，Bioss公司）；鸡抗人NT-3单克隆抗体（一抗，Stem-Cell Technologies公司）；Cy3标记羊抗兔和羊抗鸡免疫球蛋白G（IgG）（二抗，Jackson Immuno Research公司）；噻唑蓝（MTT）、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、Hoechst 33258染色液（Sigma公司）；丹酚酸B（Salvianolic acid B，Sal B）（Santa Cruz公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

MR-96A型酶标仪（深圳迈瑞公司）；NIB-100F型倒置荧光显微镜（宁波永新光学有限公司）；冷CCD数码相机、IS-Capture软件（福州图森图像公司）；Image J分析软件[美国国立卫生研究院（NIH）]。

2 方法

2.1 牛蒡苷元的制备

牛蒡子购自大连海王星辰药店，并经笔者所在学校中药鉴定教研室康廷国教授鉴定确认。参照文献[7]，将牛蒡子粉碎，过40目（0.42 mm）筛后，用10倍体积的3%盐酸水解3 h，过滤；将滤渣水洗至中性，低温烘干，用6倍体积的30%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，过滤；合并滤液，回收溶剂后，进硅胶柱层析，以CH2Cl2/MeOH为洗脱剂，梯度洗脱（CH2Cl2: MeOH→100 : 0→100 : 1），其中CH2Cl2: MeOH为100 : 1时所得馏分经溶剂回收、放置，得到无色片状结晶物，再经多次重结晶，最终获得经HPLC检测而测得纯度大于98%的Arc。

2.2 SH-SY5Y细胞的培养、分组与给药处理

取第5代SH-SY5Y细胞，按每毫升6×105个的密度接种于96孔板中，每孔100 µL，并在37℃和5%CO2环境条件下，用完全培养基（含DMEM/F12、10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素）培养3 d，用于实验。

参照文献[8-10]，取上述培养的细胞分成正常组（正常细胞）、模型组（将正常细胞用50 µmol·L-1H89孵育24 h）、H89+Arc组（即Arc治疗组，将正常细胞先用50 µmol·L-1H89预处理1 h，再加入0.1～10 µmol·L-1Arc，共孵育24 h）及H89+ Sal B组（即阳性对照组，将正常细胞先按H89+Arc组方法用H89预处理，再加入10 µmol·L-1Sal B，共孵育24 h）。

2.3 MTT法检测SH-SY5Y细胞活力

在各组SH-SY5Y细胞的96孔培养板中，每组设3个复孔，每孔加入MTT 10 µL，于37℃孵育4 h，弃去含MTT的培养基，每孔加入二甲亚砜（DMSO）150 µL，1 h后用酶标仪在492 nm波长处测定吸光度值，平行独立实验3次。将正常组吸光度值所表征的细胞活力计为100%，其余各组吸光度值与之相比而测得相对细胞活力。

2.4 免疫荧光细胞化学法检测SH-SY5Y细胞中Aβ和NT-3的表达

参照文献[11]，在各组SH-SY5Y细胞的96孔培养板中，每组取3孔培养的细胞，以4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1% Triton X-100透化20 min，加入一抗（1:100），于4 ℃过夜，次晨用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，加入Cy3标记特异二抗（1:200），于室温放置60 min，再用PBS洗涤后，加入含DAPI（1 µmol·L-1）的封片剂封片，在倒置荧光显微镜下观察，每孔取10个随机视野，并通过Image J 软件对各组细胞中Aβ35-42或NT-3阳性表达所产生的荧光强度进行扫描和定量，平行独立实验3次。

2.5 Hoechst 33258染色法检测SH-SY5Y细胞凋亡率

参照文献[10]，在各组SH-SY5Y细胞的96孔培养板中，每组取3孔培养的细胞，经固定、透化后，加入Hoechst33258染色液（0.5 mg·L-1，pH 7.4），于避光、室温条件下孵育30 min，用PBS洗涤，封片，在倒置荧光显微镜下观察细胞核，用Image J 细胞计数器计数并计算凋亡细胞百分比，平行独立实验3次。

2.6 统计学方法

采用SPSS16.0软件完成实验数据的统计处理，数据结果以s表示，组间比较采用双侧t检验。

3 结果

3.1 牛蒡苷元对H89诱导SH-SY5Y细胞活力下降的抑制作用

MTT法检测结果显示，与正常组相比，模型组细胞的细胞活力明显降低[(61.90±9.67)% vs 100%，P＜0.05]，而H89+低浓度Arc（0.1、0.25、0.5 µmol·L-1）组细胞的细胞活力较模型组明显提高，达（99.57±9.78）% ～（99.86±1.75）%（P＜0.01），与H89+ Sal B组相当，其中H89+0.5 µmol·L-1Arc组细胞的细胞活力最高，说明低浓度Arc对H89诱导SH-SY5Y细胞活力下降具有显著抑制作用；但H89+高浓度Arc（1、5、10 µmol·L-1）组细胞的细胞活力却随培养板中Arc浓度的升高而逐渐降低，尤其H89+10 µmol·L-1Arc组细胞的细胞活力仅为（55.12±18.03）%，与模型组相当，说明高浓度Arc会产生细胞毒性（见图1）。

图1 各组细胞活力比较（n=9）Figure 1 Comparison of cell vitalities among all groups

上述实验结果提示，0.5 µmol·L-1为Arc对抗H89诱导神经细胞损伤的最佳浓度。故以下各项实验中H89+Arc组所用Arc浓度均为0.5 µmol·L-1。

3.2 牛蒡苷元对H89诱导SH-SY5Y细胞中Aβ表达上调的抑制作用

Aβ免疫荧光细胞化学法检测结果可见，各组细胞胞浆中均有Aβ表达（红色荧光）， 其中模型组细胞的红色荧光最明亮且密集，几乎连成片状，而H89+Arc组细胞的荧光强度较模型组明显减弱（见图2）。进一步的Image J软件定量分析显示，模型组细胞的荧光强度比正常组增大16.73%（P＜0.01），说明被H89损伤的SH-SY5Y细胞中Aβ水平显著升高；而H89+Arc组细胞的荧光强度较模型组减小5.17%（P＜0.05），与H89+ Sal B组相当，说明Arc能显著抑制H89诱导的SH-SY5Y细胞中Aβ水平升高（见图3）。

图2 各组细胞经Aβ免疫荧光染色后的显微图像（×40）Figure 2 Microscope images of the cells after Aβ immunofluorescence staining in all groups

图3 各组细胞经Aβ免疫荧光染色后的荧光强度比较（n=9）Figure 3 Comparison of fluorescence intensities of the cells after Aβ immunofluorescence staining among all groups

3.3 牛蒡苷元对SH-SY5Y细胞中NT-3表达的促进作用

NT-3免疫荧光细胞化学法检测结果可见，正常组、模型组、H89+Arc组和H89+ Sal B组细胞中NT-3的表达（红色荧光）依次增多（见图4）。进一步的Image J软件定量分析显示，正常组细胞的荧光强度较弱，而模型组细胞的荧光强度较之增大62.35%（P＜0.05），说明被H89损伤的SH-SY5Y细胞中NT-3的表达明显上调；H89+Arc组细胞的荧光强度则又较模型组进一步增大80.54%（P＜0.01），与H89+ Sal B组相当，说明SH-SY5Y细胞受损伤后能代偿性上调NT-3的表达水平，而Arc却可进一步显著促进受损伤的SH-SY5Y细胞中NT-3的表达（见图5）。

图4 各组细胞经NT-3免疫荧光染色后的显微图像（×40）Figure 4 Microscope images of the cells after NT-3 immunofluorescence staining in all groups

图5 各组细胞经NT-3免疫荧光染色后的荧光强度比较（n=9）Figure 5 Comparison of fluorescence intensities of the cells after NT-3 immunofluorescence staining amongall groups

3.4 牛蒡苷元对H89诱导SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用

Hoechst 33258染色法检测结果可见，模型组中细胞凋亡核（箭头所指半月形或呈碎块状致密浓染的细胞核）最多，而H89+Arc组细胞凋亡核明显减少（见图6）。进一步的Image J 细胞计数器定量分析显示，模型组中凋亡细胞百分比为（27.33±1.15）%，显著高于正常组的(3.67±1.15)%（P＜0.01)； 而H89+Arc组中凋亡细胞百分比为（17.33±1.53）%，显著低于模型H89组（P＜0.05），但略高于H89+ Sal B组，说明Arc能有效对抗H89诱导的SH-SY5Y细胞凋亡（见图7）。

图6 各组细胞经Hoechst 33258染色后的显微图像（×40）Figure 6 Microscope images of the cells after Hoechst 33258 staining in all groups

图7 各组中凋亡细胞百分比比较（n=9）

4 讨论

CREB可被多种蛋白激酶催化形成p-CREB而被激活，而PKA是调控CREB磷酸化的经典通路，有实验证明该过程对脑缺血诱导的神经元损伤有保护作用[12]，其机制可能与 p-CREB能诱导细胞存活基因bcl-2表达有关[13]。H89是PKA选择性抑制剂，可通过抑制PKA降低p-CREB水平[14]，而p-CREB水平下降则能导致其下游促细胞存活的基因转录受阻，从而诱导细胞损伤[15]。

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是严重威胁人类晚年生活质量的主要疾病之一，至今缺乏有效治疗方法。Aβ异常聚集是引起AD脑内病变的重要原因之一，其脑内水平升高可下调p-CREB水平，诱导神经元损伤[16]。但脑内p-CREB水平下降是否可引起Aβ水平升高，至今尚无报道。本文以SH-SY5Y细胞为研究对象，采用PKA抑制剂H89抑制PKA活性以下调p-CREB水平，结果发现，在p-CREB水平下调的同时，细胞内Aβ的表达也增多，说明细胞内p-CREB水平的下降能诱导Aβ聚集；而经低浓度Arc干预后，细胞内Aβ明显减少，说明Arc能显著对抗H89诱导p-CREB水平下降所致Aβ水平升高，对缓解AD脑内神经元损伤有积极作用。

NT-3是神经营养因子家族成员之一，是神经元存活所必需的因子，对神经元损伤有保护作用[17]。本文的实验研究结果表明，在正常SH-SY5Y细胞中，NT-3表达水平较低；当细胞经H89损害24 h后，NT-3表达水平升高，这可能是细胞自身的保护性调节机制所致[17]，但这种自身调节并不足以逆转损伤细胞的病理过程，需用其他手段来增强NT-3表达；当用低浓度Arc干预后，受损细胞中NT-3含量显著增加，这可能与p-CREB水平升高，促进了NT-3的表达有关。

Hoechst 33258染色法检测发现，经H89处理的SHSY5Y细胞中凋亡核数目明显增多，说明H89对SH-SY5Y细胞造成了损伤，并诱导细胞凋亡；而受损细胞经低浓度Arc处理后，其凋亡核数目明显，说明Arc能有效抑制H89诱导的细胞凋亡。

综上所述，H89可通过抑制PKA，下调p-CREB水平，引起神经细胞中Aβ水平升高和凋亡数目增加；而低浓度Arc能对抗H89的损伤作用，致使受损细胞中p-CREB水平上调， Aβ水平下调，减轻Aβ对神经细胞的损害，且同时促进下游存活基因和NT-3的表达，增强神经营养因子的作用，从而发挥其对神经细胞损伤的保护作用。提示，Arc有可能成为候选的神经保护药物，在相关新药研发中具有重要的应用价值。

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Protective Effect of Arctigenin against H89-induced SH-SY5Y Cell Injury

ZHANG Nan, YANG Jingxian, SUN Dong, HU Yu, ZHAO Dan, LI Hongyan, KANG Tingguo
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China)

Objective:To investigate the protective effect of arctigenin against H89-induced human neuroblastoma SH-SY5Y cell injury. Methods: SHSY5Y cells were treated with PKA inhibitor H89 to establish the cell injury model. SH-SY5Y cells were divided into normal group (normal cells), model group (H89-treated cells), H89+Arc group (H89- and arctigenin-treated cells) and H89+ Sal B group (positive control group, H89- and salvianolic acid B-treated cells). The cell vitality, the expression of β-amyloid (Aβ) and neurotrophin-3 (NT-3) in cells and cell apoptosis rate were determined respectively by MTT assay, immunofuorescence cytochemistry staining technique and Hoechst33258 staining method. Results: The H89-induced cell injury model was successfully established. Arctigenin exerted a maximal protective effect on the cell injury model at low concentration (0.5 μmol·L-1). Compared with model group, the cell vitality was signifcantly increased (P＜0.01) , the expression of Aβ in cells was down-regulated by 5.17% (P＜0.05) , the expression of NT-3 in cells was up-regulated by 80.54% (P＜0.01) and the percentage of apoptotic cells was also signifcantly decreased (P＜0.05) in H89+ Arc (0.5 μmol·L-1) group. Conclusion: Arctigenin has a signifcant protective effect against H89-induced SH-SY5Y cell injury at low concentration.

arctigenin; H89; SH-SY5Y cell; cell vitality; β-amyloid; neurotrophin-3; cell apoptosis

R285.5; R742

B

1001-5094（2014）03-0215-05

接受日期：2013-11-11

项目资助：十一五国家科技重大专项“重大新药创制”项目（No. 2009ZX09103-423）

*通讯作者：康廷国，教授；

研究方向：中药鉴定及中药的品质评价；

Tel：0411-87586078； E-mail：kangtg@lnutcm.edu.cn