法舒地尔对急性有机磷中毒大鼠横纹肌的保护作用

汤罗嘉 姚晨玲 张晨

(复旦大学附属中山医院急诊科，上海 200032)

敌敌畏属于有机磷酸酯类农药，主要用作杀虫剂。急性有机磷中毒(acute organophosphorus pesticides poisoning，AOPP)是临床常见的危重急症。近年来，呼吸机[1]、血液净化[2]等技术的应用提高了AOPP的抢救成功率，但对于AOPP所致横纹肌损伤方面的研究甚少。研究[3]发现，Rho/ROCK信号转导系统参与了AOPP的病理损伤过程，本研究探讨了ROCK抑制剂(法舒地尔)对AOPP大鼠心肌与骨骼肌的保护作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性Sprague Dawley大鼠24只，8周龄，体质量210～230 g，由复旦大学附属上海医科大学实验动物中心提供(许可证号 SCXK沪2009-0019)，在复旦大学附属中山医院动物房适应性饲养1周。

1.2 主要仪器与试剂 敌敌畏原液(上海允发化工有限公司)，加注射用水配置成1 g/L溶液；法舒地尔注射液(天津红日药业股份有限公司)；大鼠肌酸激酶同工酶MM(creatine kinase isoenzyme MM，CK-MM)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒、大鼠乳酸脱氢酶同工酶M(lactate dehydrogenase isoenzyme M，LDH-M)ELISA检测试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；自动生化分析仪(VITROS950，美国琼森公司)；逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)仪(7500 Fast，美国ABI公司)；DW-2000动物人工呼吸机(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.3 实验分组 将24只大鼠随机分为对照组、中毒组、干预组，每组8只。大鼠手术前晚禁食不禁水，称体质量后，经腹腔注射3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉。将大鼠固定于仰卧位，分离颈部组织作气管插管，连接DW-2000动物人工呼吸机，作人工呼吸(60次/min)。对照组经腹腔注射0.9%氯化钠液0.4 mL，中毒组和干预组均经腹腔注射敌敌畏30 mg/kg(LD50)。干预组在麻醉前30 min经腹腔注射法舒地尔10 mg/kg。腹腔注射后2 h采集血样，在该时间点之前死亡的大鼠排除在本研究之外。

1.4 血清标本测定 腹腔注射后2 h，经颈动脉置管放血，血标本静置15 min，以5000 r/min离心3 min，取上清液，-80 ℃冰箱保存。应用自动生化分析仪检测血清心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)水平；采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清CK-MM、LDH-M水平。

1.5 横纹肌ROCKI mRNA表达的检测 采血后，各取大鼠左侧腓肠肌及左心室心肌组织50 mg，加入1 mL Trizol液，充分匀浆。采用RT-PCR法分别检测左侧腓肠肌及左心室心肌ROCKI mRNA的表达。引物由上海英俊生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

SYBR Green 10 μL，上游引物(5 μmol/L)1 μL，下游引物(5 μmol/L)1 μL，反转录产物2 μL，加水至20 μL，进行PCR扩增；PCR反应条件为：95℃，10 s；95℃，5 s；60℃，2 s；共40个循环。

表1 ROCKI和β-actin基因的引物序列及片断长度

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 对照组大鼠无异常表现。中毒组、干预组大鼠在腹腔注射敌敌畏后均出现呼吸道分泌物增多、肌肉痉挛与颤动、两便失禁等AOPP症状。所有症状在中毒后5～7 min出现并达到发作高峰，持续30～60 min。干预组的症状相对较轻，分泌物较少，肌肉颤动幅度与频率小。

2.2 血清学结果 与对照组比较，中毒组与干预组大鼠血清cTnT值均升高(P<0.05)，而干预组的升高幅度明显小于中毒组(P<0.05)。对照组、中毒组与干预组大鼠血清CK-MM、LDH-M值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 大鼠血清cTnT值及CK-MM、LDH-M值的变化比较

2.3 横纹肌RT-PCR检测结果 (1)左心室心肌ROCKI mRNA值：与对照组比较，中毒组表达增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与中毒组比较，干预组表达受到显著抑制，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)左侧腓肠肌ROCKI mRNA值：与对照组比较，中毒组表达增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与中毒组比较，干预组表达受到显著抑制，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3横纹肌ROCKImRNA的相对表达值

注：与对照组比较，aP<0.05；与中毒组比较，bP<0.05

3 讨 论

应用抗胆碱药与胆碱能复活药治疗AOPP，可以对抗毒蕈碱样(M样)症状与部分烟碱样(N样)症状。重症AOPP患者常伴有心力衰竭、骨骼肌痉挛、强直、呼吸衰竭。对此类患者，在加大解毒剂治疗剂量的同时，也增加了药物的不良反应，如阿托品中毒及呼吸抑制等。

国外学者[3]在大鼠急性敌敌畏中毒实验中发现，应用Rho抑制剂Y-27632预处理后，大鼠死亡率明显下降。提示Rho/ROCK信号通路可能参与了AOPP中毒的机制。

本研究发现，AOPP时，应用法舒地尔干预后，大鼠左心室心肌及左侧腓肠肌ROCKI mRNA表达受到抑制，横纹肌的中毒症状减轻，中毒指标好转；与中毒组比较，干预组血清cTnT值升高幅度明显降低，表明法舒地尔对AOPP大鼠横纹肌有保护作用，此保护作用与下调ROCKI mRNA表达、抑制Rho/ROCK通路密切相关。

法舒地尔是一种ROCK抑制剂。ROCK被认为是各种信号途径特别是调节肌动蛋白-肌球蛋白收缩信号的整合点。ROCKI是在心肌、肺和骨骼肌分布为主的亚型，参与了许多重要生物学行为的调控，细胞的增生和分化、运行和移行、生存和死亡[4-5]都与其相关。

ROCKI作用的经典底物主要包括：肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)、肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)。Rho/ROCK途径可通过直接作用于MLC或间接作用于肌球蛋白磷酸酶靶蛋白1(MYPT1)来增加胞浆内MLC的磷酸化程度，维持细胞收缩[6]。在AOPP时，心肌与骨骼肌的Rho/ROCK信号通路被激活，肌肉兴奋性提高。法舒地尔通过抑制ROCK的过度表达，一定程度上减轻了横纹肌的中毒症状，起到了保护作用。

本研究发现，虽然应用法舒地尔可以使AOPP大鼠骨骼肌痉挛的症状得到缓解，但是相关肌酶中只有心肌酶CTnT的表达显著下降，而CK-MM与LDH-M在中毒组与干预组间的差异无统计学意义，原因可能与测定指标的敏感性与时效性相关。

[1]蔡志芳,王雪峰,姚汉玲,等.重度有机磷中毒患者早期应用机械通气的临床效果观察[J].临床肺科杂志,2013,18(11):2116-2117.

[2]Yu HJ,Shen DF,Liu B,et al.The observations of curative efficacy of rhubarb combined with blood purification on treatment patients with severe acute organophosphorus pesticide poisoning[J].Chinese journal of industrial hygiene and occupational diseases,2012,30(4):304-306.

[3]Gunay N,Kose B,Demiryurek S,et al.Effects of a selective Rho-kinase inhibitor Y-27632 on oxidative stress parameters in acute dichlorvos poisoning in rats[J].Cell Biochem Funct,2008,26(7):747-754.

[4]Di Cristofano A,Pandolfi PP.The multiple roles of PTEN in tumor suppression[J].Cell,2000,100(4):387-390.

[5]Hall A.Rho GTPases and the actin cytoskeleton[J].Science,1998,279(5350):509-514.

[6]Deaton RA,Su C,Valencia TG,et al.Transforming growth factor-beta1-induced expression of smooth muscle marker genes involves activation of PKN and p38 MAPK[J].J Biol Chem,2005,280(35):31172-31181.