植物组织培养中存在的问题及其预防措施

王昱淇

摘 要 针对存在于植物组织培养过程当中的污染问题作具体分析，包括对于引起污染原因的科学认识和研究污染的意义所在，并提出了预防污染的有效措施，包括对于外植体自身灭菌和控制人为因素两方面，以期为工厂化生产提供一定的科学参考。

关键词 植物组织培养；污染；预防措施

中图分类号：Q943.1 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2014）12-0134-09

自20世纪初，德国植物生理学家哈布兰特提出一个观点即高等植物可以由植物器官和组织不断分割，最后可以分到单个细胞水平，并加以设想，离体的组织器官可以通过植株再生性，从而在实验的条件下形成完整植株的能力，这就是哈布兰特提出的植物细胞全能性理论。

20世纪初，植物组织培养同样兴起，并经历了3个阶段，分别为，探索阶段，奠基阶段，迅速发展阶段。植物组织培养技术已经得到了长远的发展，应用于工厂化的植物组织培养育苗技术就是一个很好的例证，且在农业、林业、医药等领域植物组织培养技术同样产生了巨大的经济效益和社会效益。

鉴于植物组织培养技术在我国日趋完善，且工厂化育苗生产也随着经济发展而在我国呈现出强势的发展势头，在市场竞争下，由于如何降低生产成本是增长经济效应的关键所在，因此，对于植物组织培养当中产生的污染问题导致经济效益的下降应当引起我们的高度重视。

因此，在植物组织培养过程当中，采取富有成效的预防措施，降低外植体被污染的概率，是工厂化组织培养成功与否的关键。

由此，从分析污染原因出发，并提出了在组培过程当中存在的污染原因及其特性，并以此为据，提出了在组培过程当中如何有效预防污染的措施，以期能为工厂化育苗生产提供理论参考和技术支持。

1 植物组织培养的定义

植物的组织培养是近年来发展起来的一项新的科学技术，属于无性繁殖，且是根据细胞具有全能性这个理论来施行的。广义的植物组织培养被定义为离体培养，这是指在无菌操作条件下，通过从植株中分离出适当的器官组织或者原生质体等，进行人工的控制和选育培养，以期获得再生植株或者具有经济效益的其他产品。相对于广义来说，狭义的组织培养是指在无菌培养过程当中产生的愈伤组织，可以通过植株体的再分化从而形成新的再生植物。

2 污染的原因特点及意义

2.1 污染的概念

2.1.1 污染的概念

植物组织培养污染，指在植物组织培养过程当中，被采取的植物组织材料，在适合微生物生长的环境条件下，诸如适宜的温度湿度，PH值和培养基中过多有机物质的添加，由于真菌、细菌等微生物的侵染，都会导致在培养过程当中发生培养体系被污染的现象。因此，控制组培过程当中的污染问题对工厂化试管苗的质量保证尤为重要。

2.1.2 污染的种类

根据受污染的对象不同，受污染的阶段不同，可以将污染主要分为以下几类。

2.1.2.1 材料带菌

材料带菌主要是指外植体污染，这与外植体自身的生长环境有关，因为从外采集回来的外植体培养材料本身就普遍带有病菌，且这些病菌可能分布在其内部或者表面上。

2.1.2.2 初代培养污染

在初代培养过程当中产生的污染菌落是指，在具体实验过程当中，由于操作不慎或者瓶口封口不严掉进的病菌孢子，接种到培养基上，在3～7 d后，外植体周围会出现带有颜色的菌落，且此种情况大多是真菌感染，若出现白色菌落或脓状物，则多为芽孢杆菌或细菌污染。因此种污染是外植体本身所带来的污染，所以，在杀菌过程当中很难清除。

2.1.2.3 继代培养污染

经过1次或者数次继代培养之后，原本在初代培养当中生长良好，且无任何杂菌污染的种苗周围也会出现诸如初代培养当中的白色云雾状物质或者带有颜色的菌落和脓状物。

2.2 污染的原因

2.2.1 病原菌方面的分析

从病原菌方面来分析时，造成植物组织培养污染的主要原因来自于细菌和真菌的污染，次要原因为酵母菌和放线菌的污染。

2.2.1.1 细菌污染

细菌污染是指，一般在接种后1～2 d时即可发现，在培养基表面或者培养材料的周围会出现黏液状和发酵泡沫状物体，或者会发现混浊和云雾状痕迹出现在培养材料附近的培养基中，其中以芽孢杆菌污染最为普遍，因为芽孢杆菌自身可以耐受一定的高温和高压，并且对消毒剂和紫外线有一定的抗性，所以此种污染对细菌污染来说，最为严重。

2.2.1.2 真菌污染

真菌污染主要是指霉菌引起的污染，一般接种后3～8d后，会引起培养基表面被污染的部位发霉，导致培养基中出现颜色多样的菌斑，继而出现黑，白，绿，黄等孢子。

2.2.1.3 内源菌污染

内源菌污染是指在对外植体材料进行表面消毒时，由于外植体材料内部，主要指细胞内或细胞间的微生物不能被清除，从而对培养过程造成污染，由此，造成的污染后果主要为，在组培早期会致使培养失败，植株增殖概率降低，培养物生长速率减缓，玻璃化苗增加；在组培后期会致使试管苗过早死亡或对试管苗移栽困难。

2.2.2 外植体方面的分析

外植体是指由活体植物上切取下来的部分组织或者器官进行体外组织培养，所以，对外植体进行合理的选择是使组培工作顺利进行的关键。

2.2.2.1 外植体的取材部位和季节

从取材部位和取材季节来说，一般情况下，由于植物的茎尖处，生长速度快，遗传稳定性好，且植物体本身所带病毒含量较低，因此，是比较好的外植体取材部位。

2.2.2.2 外植体的取材地点和大小年龄

从取材地点和外植体的大小年龄来说，根据取材部位的带菌量多少，因避免在以下情况下，选取组培材料，生长在室外，取材表面带有大量泥土，植株深入地下部分。由于成年或衰老植株生长代谢缓慢，容易遭受部分细菌感染，所以在选择外植体年龄上，因选择年龄适中，大小适合，且不易被细菌或者病毒感染，易于杀菌灭菌的外植体。endprint

2.2.2.3 取材外植体的适宜时期

对外植体取材较为适宜的时期是在取材的材料休眠末期，或者是在取材材料的萌动前期，因为此时材料中积聚了很多的营养物质和内源激素，此时材料的抗逆性强，并且一些内源菌在此时还未达到菌体活跃期。

2.2.2.4 对外植体进行预处理

对外植体进行预处理可分为2类，其一是对外植体进行低温预处理；其二是对外植体进行热水浴处理，李群用热水浴处理马蹄莲，效果达到最好时的温度为48℃，此时的污染率较低，且此处理方式对材料不会产生副作用。

2.2.2.5 外植体的消毒方法

目前，常用的消毒剂有0.1%～1%升汞，2%～10%次氯酸钠，70%～75%酒精，饱和漂白粉溶液等。且对于植株不同部位的消毒可以采取不同的消毒方式。

对外植体表面灭菌，选择适合的消毒剂和控制适合的消毒时间是影响外植体表面灭菌的关键所在，应根据不同植物和同一植物的不同部位进行消毒方式的合理选择，由此，就需要根据不同外植体的具体情况，选择合适的消毒剂和消毒时间。

对带有内生菌的外植体消毒，相比于外植体的表面消毒，对容易携带内生菌的外植体消毒在形式上要复杂很多。其主要方法有，其一，采用超声波，热击等物理处理方法先对外植体进行处理，再进行常规的表面灭菌，例如，G.M.G.M.Hol等以水仙的鳞茎为外植体进行组培时发现，如果采用1%的次氯酸钠对其进行消毒时，但灭菌时间控制在

30 min时，污染率可保持为40%～60%，且对灭菌时间进行延长仍然不能减少污染率，但若配合热水浸泡并使用消毒剂，可使污染率降低到5%左右。其二，在消毒液中添加表面吸附剂吐温20。其三，可在培养基中添加抗生素来防止组培过程当中的污染，且在使用抗生素进行防止污染的过程当中要注意使用抗生素的种类和量剂浓度，当浓度低或者高时，都有可能对作用植株产生毒害作用[1]。

2.2.3 培养条件方面的分析

这类污染一般是指，除了外植体自身带菌和环境污染之外的一些人为污染因素，且此类污染只要注意得当，一般是可以在生产实践中得到避免的。

2.2.3.1 外植体培养条件

在外植体的培养条件中，与产生污染率相关的条件主要有培养室的温度和湿度。在温度适宜，湿度较大的环境条件下，利于外植体表面及内部杂菌的生长，相反，在干燥的环境条件下，外植体被杂菌感染的概率相对较低。

2.2.3.2 组培植株生长环境

选用于组织培养植株自身的自然生长环境也会影响组培过程当中的杂菌污染率，因此，在选取外植体植株时，应尽量避免选取生长在高温多雨环境当中的多年生草本植物。

2.2.3.3 培养基的制作与灭菌

因培养基灭菌不彻底而产生的污染多半是由细菌和真菌引起的，因此，对于培养基的制作与灭菌操作时，应主要注意在制作培养基时，不应使用已长菌的母液来配制培养基，且应控制培养基的pH值在适当范围内，不宜过高，不应添加过多利于杂菌生长的有机成分，致使培养基受到污染。

2.2.3.4 空白培养基污染

根据菌落出现在培养基中的不同部位，可以分为两种情况，其一，当菌落出现在培养基表面时，引起污染的原因可能是瓶塞不严，扎口不紧，或者培养基周围环境不干净所致。其二，当有白色云雾状物出现在培养基的内部时，其可能引起污染的原因是由于在灭菌过程中，控制灭菌的时间或者气压不够造成的。

2.2.3.5 培养和接种所用器具

对于培养和接种时所用器具，例如，操作器械、器皿，包括镊子、剪子、刀片、三角瓶、培养皿、瓶塞、超净工作台、酒精灯等接种操作时用到的一切器具，用完时，应做到及时清理干净并进行干燥保存，待下次再用时，应先检查培养器具是否清洁，避免因外界因素而导致的不必要污染。

2.2.3.6 接种人员的卫生灭菌意识

因无菌操作不慎而导致的污染更是工厂化生产中不容忽视的重要因素，这主要表现为，因最大的带菌者既是进行无菌操作的工作人员，其身上，头发中都携带着很多的微生物，且由于接种人员自身的卫生灭菌意识不高，接种操作不规范，服装、帽子、口罩、拖鞋等经常使用的衣物品未进行定期清洗与消毒处理，也会造成组培过程当中的杂菌污染。

2.2.3.7 接种室培养室的选择

对于接种室和培养室的选择方面，应首先对接种室和培养室进行合理的设计，避免因工作人员进出时所带来的杂菌污染，组培室和接种室的门窗应做好封闭，防止空气中的污染源，如苍蝇和小昆虫不慎飞入，导致杂菌传播污染。

2.2.3.8 无菌室或超净台灭菌不彻底以及滤出的空气中带菌数超标

组培过程当中产生的污染多半是由于寄生虫和其他带菌生物引起，且通过昆虫媒介也会将空气中的真菌孢子带入到材料当中，这些都是由于无菌室灭菌不彻底造成的，所以，对于无菌室的灭菌操作应严格遵守规定。

2.2.3.9 交叉污染

交叉污染在实验中主要体现在2方面，一方面，接种时由于接种用具灭菌不彻底，且外植体材料自身带有内生菌时，将部分未污染材料与污染材料放在一起接种时，就会导致组培过程当中，原先未污染的材料被污染；另一方面，由于疏忽致使空气当中的真菌孢子或者被污染苗污染到其他培养基，都会导致交叉污染。

2.3 研究污染的意义

在组织培养过程当中，污染一直是工厂化生产所亟待解决的主要问题，如能把组培过程当中的污染率降低到一个很小的范围之内，不仅可以提高培养成活率，还可以降低因微生物污染引起的试管苗死亡率，从而减少生产成本，提高整体的经济效益和社会效益。

且控制污染的潜在价值也主要表现在2个方面，（1）对于很多植物苗木的规模化生产来说，控制污染，可以促进对植物试管基因库的构建，且对一些出现在实验中间环节当中的宝贵实验材料起到免受污染的损失。（2）对于一些取材外植体是珍惜物种来说，因这类材料不易获得，或价值昂贵，所以，应尽量降低初代培养污染，并迅速建立起无菌系，这对减少生产投入成本也至关重要[2]。endprint

3 污染的预防和控制

3.1 外植体的处理

3.1.1 外植体的选取

一般情况下，外植体的选取以带菌少、表面积小的组织，避免阴雨天采集为宜，且培养无菌外植体也可减少组培过程当中的污染，使组培成功率上升。

3.1.1.1 外植体选取以带菌少的材料为宜

外植体的选取应以本身携带污染少易于培养为宜，且经常被选用的外植体为植物胚，因为此外植体具有分生组织，易于快速培养，另外，再用茎尖作为外植体时，一般可先在无菌的环境中对取材部位进行预处理培养，由此，可使组培过程当中的污染率下降20%～30%。且在选用植株的其他部位进行培养时，可采用2次灭菌法，以减少杂菌对之后的培养过程造成的污染。

3.1.1.2 选取表面积小的外植体

孟杨等在湖北百合组织培养技术研究中发现，接种时对鳞片大小分割不同时，其组培过程当中的污染率也会相应不同，例如，0.5 ㎝×0.5 ㎝的鳞片，其污染率为5%，0.8 ㎝×0.8 ㎝的鳞片，其污染率达到了8.3%，由此可以看出，选取材料时，表面积小的材料其带菌率相对较低，因而其污染率也相应减少，所以，一般情况下，在选取材料时，应避免选取块根块茎和鳞茎类的植物，因为这类植物多半常年生活在地下，因此其本身会携带更多的细菌，不利于生产过程当中的除菌操作[3]。

3.1.1.3 采取外植体应避免阴雨天气

在采集外植体时，由于环境当中的湿度增大可使外植体染菌概率上升，所以应避免阴雨季节外出采集外植体，而相对于阳光充足的夏季来说，因为日晒可以杀死部分细菌以及微生物，可使组培过程当中的污染率下降。

3.1.1.4 培育无菌外植体

近年来，培育无菌苗作为外植体取材已经是一种非常有用的方法，其操作过程为，在无菌条件下，将种子经过严格灭菌后培育成无菌苗，之后再用无菌苗的胚轴，胚根，子叶等作为外植体，通过此方法，可减少组培过程当中的污染，也可使组培成功率上升。

3.2 外植体的灭菌处理

现有的关于外植体的灭菌方法主要有抗生素处理、热处理、低温处理、臭氧消毒、添加灭菌剂处理、真空减压灭菌、使用热击、杀菌剂或抗生素对外植体进行预处理、多种药剂交替浸泡法、磁力搅拌和超声波振动、多次灭菌、灼烧、多种灭菌剂混合使用，在培养基中加入抑菌剂等。

3.2.1 抗生素处理

对于组培过程中母体材料被严重污染的情况，可以采用喷施抗生素进行杀菌处理，Rugge等先用敌菌丹或异菌脲对田间披散山龙眼母树进行处理后，再采集外植体，由此，其污染率由对照的90%降低到14%，另外，Mondal等先用1 000 mg/L的庆大霉素喷施番木瓜，后采集外植体再用庆大霉素处理，此法也减少了组培过程当中的污染率[4，5]。

3.2.2 低温或者热水浴处理

在对于玫瑰枝条外植体采集污染程度的实验当中，可以发现，事先对培养材料进行低温或热水浴预处理可以有效降低污染率，这可能与受污染的杂菌体内酶活在不适宜温度下失活有一定关系，因此，对植株材料选取适当的预处理也是一个十分有必要的操作。

3.2.3 臭氧消毒

焦立为等用臭氧对橡皮树带有顶芽的叶片进行消毒后，其污染率为0%，且其被鳞叶包被的顶芽接种后的成活率极高，而叶片和叶脉接种后成活率很低[6]。

3.2.4 添加灭菌剂处理

在对外植体进行添加灭菌剂处理时，常用的灭菌剂主要有70%酒精，0.1%～1%升汞（氯化汞）、1%～10%滤液的漂白粉、0.5%～10%次氯酸钠溶液、3%～10%双氧水和4～50 mg/L抗生素，其中70%酒精为常用灭菌剂。

3.2.5 减压灭菌处理

周俊辉等对玛丽安万年青采用减压灭菌，此方法的作用原理在于，利用减压操作，使得植物组织中的气体被抽走，因此，致使消毒剂更容易进入到植物组织内部，从而起到增强灭菌效果的作用。并使污染率从对照的93.3%减少到40.0%，此外，郭海滨等将卷丹百合鳞片先在70%的酒精中浸泡10 s，再用0.1%氯化汞消毒12 min，污染率可降低到65%，而用酒精浸泡30 s时，再用氯化汞浸泡15 min，其污染率可减少到15%。另外，许婉芳等在金钱莲培养基中加入杀菌剂的实验中发现，浓度为50%的多菌灵比浓度为70%的甲基托布津和25%甲霜灵的除菌效果更好，在抑菌率达到100%以上时，还可以促进金钱莲的生长[7-9]。

3.2.6 使用热击，杀菌剂或抗生素对外植体进行预处理

李群等用48℃的水浴及低温对不同的材料进行处理，都取得了良好的效果，且其污染率控制在了相对较小的范围之内，而且使用此方法对材料本身并没有毒副作用，利用广泛使用[10]。

3.2.7 多种药剂交替浸泡法

对于一些容易污染且又难以灭菌的材料通常会采用多种药剂交替浸泡法进行灭菌。李颖、李春燕用多菌灵和青霉素的混合液浸泡被污染的试管苗，并有效杀死真菌，取得了理想的杀菌效果。另外，在超净工作台上用酒精和氯化汞对事先用自来水冲洗了半小时的被污染的组培苗进行短时间处理后，实验结果表明，再度污染率几近为零，因此该消毒方法效果良好[11，12]。

3.2.8 磁力搅拌和超声波振动

肖显华等用0.1%升汞对苹果的茎段进行磁力搅拌15～20 min后，再用无菌自来水磁力搅动清洗5次，每次5 min，有效地降低了污染率和死亡率[13]。

3.2.9 多次灭菌

王彭伟等对肾蕨幼嫩走茎用75%乙醇浸泡10 s之后，用无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞+0.5% NaC1+吐温浸泡5 min，然后用无菌水冲洗3次，接种前再用2.5 mg/mL的卡那霉素或四环素液浸泡片刻取得较好的灭菌效果，既能较好地控制污染，又不损伤材料。此法在番木瓜、金线莲、菊芋、牛大力灭菌时也有应用，效果较好[14-17]。endprint

3.2.10 灼烧

Ruiz等将马蹄莲的根在95%乙醇中浸泡1 min后，短时间地灼烧了2次，外植体切割时也灼烧了2次，与常规消毒相比，其污染率降低了60%。此法也在蒜的小鳞茎和银白杨芽的消毒过程中有所应用[18，19]。

3.3 培养条件的控制

3.3.1 培养基进行严格灭菌

常用的灭菌方法是湿热灭菌法，待锅内压力上升到0.105 mPa，即温度为121℃时，灭菌15～30 min，且灭菌锅内不应装的过满，从而影响灭菌效果。另外，应将灭完菌后的培养基放置在储备间中3～5 d再用，谨防因灭菌不彻底而对培养基造成的污染。

3.3.2 将培养基中的有机成分去除

引起组培过程当中的主要原因是因培养基中存在有机成分，所以去除有机成分是减少污染率的一个十分行之有效的措施，其原因在于有机物可以为微生物提供良好的营养条件，因此，若去除此有机物，即可减少该微生物对组培过程的污染。宋锋惠等在阿月浑子的组培中，除去烟酸等，经2～3代培养后，能抑制细菌生长，并对丛生芽生长增殖没有影响[20]。另有由日本千叶大学的古在丰树教授首创的植物组织培养无糖快繁技术，是以二氧化碳作为碳源，并且完成去除了培养基当中的有机成分，如糖、维生素、氨基酸等，让植物通过光合作用进行自养生长，经此法，其污染率有所减少[21，22]。

3.3.3 添加抗生素

可在培养基中添加抗生素作为防止污染的辅助措施，且在使用抗生素时，应注意必须要知道抑制的菌种种类，这样才能准确控制抗生素的浓度和处理时间，并且不会使抗生素对植物组织造成损伤。

3.3.4 培养容器

在植物组织培养的过程当中，多半采用试管、三角瓶、果酱瓶之类的培养容器，因为此类容器密封性能良好，且体积较小，可有效降低培养过程当中的污染。

3.3.5 接种工具

对于玻璃器皿一般采用2种灭菌方法，（1）湿热灭菌法，具体为，使用牛皮纸或者报纸对需要消毒的器皿进行包扎，之后放入灭菌锅中进行高温高压灭菌，时间控制在20～30 min。（2）干热灭菌法，具体为，将需要消毒灭菌的器皿清洗干净并进行包扎后，放入到电热烘干箱中，在160℃时灭菌1 h。

3.3.6 接种过程中的注意事项

3.3.6.1 接种前准备工作

接种前应对接种室进行20～30 min的紫外灭菌，接种时应用75%的酒精擦拭超净工作台台面和双手，接种器具在未接种时应在酒精灯火焰上进行灼烧，且应定期对接种室进行喷雾降尘和灭菌

处理。

3.3.6.2 接种规范化操作

初代接种时除严格按规程操作外，接种时培养基瓶口要在火焰上转动烧烤，继代转接时，对选用的扩繁材料在进接种室前，要用75%的乙醇进行外部消毒，打开瓶口后应倾斜向着火焰，动作要轻，幅度应适中，每次接种后器械需在95%的乙醇中浸泡，然后在火焰上灼烧灭菌，并且在接种期间，要不断用70%的乙醇擦手及工作台。

3.3.7 接种室和培养室的灭菌与管理

3.3.7.1 灭菌方法

一般情况下，常用的灭菌方法主要有用甲醛与高锰酸钾以10∶1比例混合均匀后，进行熏蒸操作。具体为，首先将接种室与培养室进行密封，之后将称好的高锰酸钾倒入容器中，再将称好的甲醛也慢慢倒入容器中，然后将接种室与培养室的门窗密封之后进行熏蒸，一般持续3 d，熏蒸结束后，将门窗打开，做好通风换气工作，并搬走废液缸，此法在1 a内适宜熏蒸1～2次。

另外，可用紫外照射法进行灭菌操作，其具体做法为，使用265～266 nm的波长对接种室和培养室每次进行20～30 min的紫外灭菌照射。

3.3.7.2 周围环境管理

对于冬春季节来说，由于气候干燥且风大，所以会使培养室中积累灰尘，致使螨虫繁殖，造成菌尘共存现象，此时应对培养室和接种室进行经常性的打扫与洒水，并应保持室内的清洁，勿乱摆放东西，丢弃废液废物。对于夏秋季节来说，因为此时培养室内多潮湿，这有利于真菌的繁殖，因此，应增加排气扇的换气次数，并且保持空气干燥，且应及时处理已经被污染的组培苗，处理时，不要轻易打开，最好先使用湿热灭菌法进行处理，以防止真菌或者细菌孢子在空气中进行扩散。

3.3.8 操作人员必须进行严格的无菌操作

在接种前，操作人员应在室外将白大褂和拖鞋换好之后再进入到接种室当中，且衣物与鞋子，应该进行定期的清洗与消毒处理，以防污染。此外，在接种完之后，还应定期对超净工作台进行检查与维修清理工作，尤其应当注意紫外灯和滤板的清理，此外因多加检查培养容器，以防止玻璃器皿因不慎碰撞而造成破口或者裂缝时，使得容器因密封不严而造成不必要的污染。若出现此种问题，应当对器皿进行替换[22]。

3.3.9 对培养物进行反复检查

对于已经获得的无菌材料来说，污染也有可能会出现在继代培养上，发生此现象的原因，有可能和外植体自身带有的内生菌活动有关，并且也会因操作过程当中的不慎而导致染菌，因此，对于有些在继代几次培养之后才会出现的污染情况来说，如对培养物不进行反复检查，就有可能会遗漏掉这部分的污染，因此，若发现此类情况时，应及时对接种室和培养室进行紫外线照射或者药物熏蒸灭菌操作，并且对已经被污染的母瓶材料应该及时清理，以防对之后的组培过程产生污染[23]。

4 结语

植物组织培养技术在科学技术的不断发展中展现出了越来越广阔的应用前景，而在组培过程当中控制或者减少污染率无疑可以更好的完善这项先进的技术，并且是组培生产取得成败的关键所在，且不管采取何种防止污染的措施应用在组培过程当中时，都应要注意，除了保证防止污染效果良好之外，还应充分考虑到经济价值问题，同时不应与外植体的增殖分化生长相悖。endprint

通常来讲，这就需要一方面将外植体材料上的病菌除去，另一方面又要保证在去除的过程当中，不损伤到材料表面，或对材料造成轻微损伤都是可以接受的范围，只要不影响其接下来的生长和分化增殖[24]。

通过对污染源的充分认识，组培外植体的有效处理以及严格执行无菌操作等措施都可以有效地降低植物组织培养过程当中的污染率，但对于不同的外植体或者同一外植体的部位进行消毒灭菌时，应考虑到，不同植物的不同特点，对不同的消毒剂也会有不同的反应，因此，在组培过程当中，控制污染的方式相当多，所以在外植体灭菌中，除了采用常规的化学物理方式外，越来越多的新技术也被应用，这主要包括，利用真空减压灭菌、磁力搅拌、超声波振动、混合消毒液等方法。

另外，采用二次排气法也可以提高高压灭菌的效果，或者使用抗生素进行灭菌，并应注意防止在组培过程当中，病菌产生抗药性。另外，抗生素也有弊端，因为一般遇到酸碱，或者加热时，抗生素往往会分解，从而失去药物活性，因此，这时若用抗生素进行组培过程当中的防止污染操作时，必定会增加生产成本，从而减少经济效益。由此，也提出了以后对于寻找新的更加稳定且耐高温高压的抗菌剂的新研究方向[25]。

目前，组培研究多集中在无菌操作空间、无菌培养空间和研究获取高效的抗生素上，今后，对于开创新的组织培养方法和培养条件也是一个研究的重点方向，如，组培的开放式培养以及无糖组培的研究进展[26]。

另外，目前对于酵母菌污染的研究相对较少，且在植物组培中霉菌的污染会造成越来越大的损失，因为霉菌污染时，污染速度快，时间短，且较难以控制，所以，对此研究也是非常有必要的。

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